發酵罐生產的蕎麥酒營養及活性成分的研究

陳勤怡，孫亞利，2，周文美，2*，周 敏，2，姜 瑩，2

（1.貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

《中國蕎麥品種資源目錄》中收錄的蕎麥資源共有2 795份[1]，蕎麥作為藥食同源性植物，同時兼有很高的營養價值跟藥用價值[2-3]。蕎麥蛋白是蕎麥主要的生物活性成分[4]，并且氨基酸配比均衡[5]，蕎麥蛋白與小麥蛋白之間最大差異在于清蛋白和球蛋白的含量明顯高于醇溶蛋白和谷蛋白[6-8]。蕎麥淀粉的糊化特性[9]與小麥、大米和玉米相似[10-11]。研究表明，甜蕎直鏈淀粉含量為25.82%～32.67%，高于苦蕎淀粉（25.5%～26.5%）[12]。蕎麥淀粉具備耐消化淀粉特性，可作為糖尿病患者良好的補充食品[13-15]。蕎麥中含有9種脂肪酸[16]。對調節人體血壓、降低“三高”以及促進酶的催化、預防心血管疾病等都有良好的作用[17]。

隨著蕎麥保健食品的開發與應用[18]，蕎麥酒作為現代蕎麥開發的一項重要產品脫穎而出。有研究表明，蕎麥酒中不僅含有豐富的蛋白質、氨基酸、維生素、礦物質、微量元素等基本營養物質，同時含有黃酮類物質、有機酸及多酚類等多種特殊功能活性物質[18]。具有降低人體血脂和膽固醇、軟化血管、保護視力和預防腦血管出血等作用[19]。

本實驗通過對發酵罐生產的蕎麥酒中蛋白質，游離氨基酸、有機酸以及總多酚含量等營養及活性成分進行測定[20]，對蕎麥酒進行綜合性評價[21]。旨在開發新型資源利用方式，改善傳統發酵工藝，提高蕎麥中的營養因子的利用率，制備風味獨特的蕎麥酒[22]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蕎麥酒：實驗室自制；黃酒（G-H）（五年）、黃酒（T-H）（五年）、黃酒（K-H）（五年）：市售；氨基酸標準混合液（WAKO）：日本和光藥業株式會社；福林酚（Folin-Ciocalteu）（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸標準品（色譜純）：貴州迪大生物科技有限公司；水楊酸（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；Tris（分析純）：Beijing Solarbic Science；抗壞血酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、乳糖（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；牛血清蛋白（分析純）：生工生物工程（上海）有限公司；高峰-α-淀粉酶（2 000 U/g）：源葉生物有限公司。

1.2 儀器與設備

L-8800氨基酸自動分析儀：HITACHI（日立）公司；GTR16-2高速冷凍離心機：北京時代北利離心機有限公司；UV-2550紫外-可見光分光光度計：日本島津儀器公司；722s可見光分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；FA2004N分析天平：上海箐海儀器有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱：上海博訊實業有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 蕎麥酒的發酵罐制作工藝

操作要點：

粉碎：甜蕎與苦蕎粉碎，過40目篩，備用。

液化：按1∶2的比例稱取甜蕎與苦蕎粉，料液比為1∶4（g∶mL），調節pH至6.5，加入0.5%高峰-α-淀粉酶、在90 ℃條件下液化40 min。

糖化：冷卻液化后的樣品至室溫，糖化酶添加量為5%，調節pH至5.0，在60℃條件下糖化50 min后進行滅菌。

發酵罐發酵：將滅菌后的樣品加入滅菌后的發酵罐內，酵母添加量為0.6%，灌裝量在總體積的2/3左右，調節罐內通氣量，設置轉速為100 r/min。控制罐內溫度為31℃進行發酵，發酵時間為7 d。

澄清：以殼聚糖添加量為0.6g/L，皂土添加量為0.2g/L，進行澄清，澄清時間為2 d。

灌裝：將澄清部分的酒液進行灌裝。

滅菌：在65～70℃條件下保溫12～15 min。

1.3.2 蕎麥酒中可溶性蛋白質含量測定[23]

采用考馬斯亮藍法，精確吸取0、0.02 mL、0.04 mL、0.06mL、0.08mL、0.10mL標準蛋白液（1mg/mL）于6支10mL具塞試管中，分別加入0.10 mL、0.08 mL、0.06 mL、0.04 mL、0.02 mL、0 mL蒸餾水，再依次加入3 mL考馬斯亮藍G-250試劑，蓋塞、混合均勻，靜置2 min，在波長595 nm處測定吸光度值，以牛血清蛋白溶液質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制蛋白質標準曲線，得線性回歸方程。

取經稀釋20倍后的蕎麥酒樣品1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，設計三組平行實驗，測定其吸光度值并根據回歸方程計算出蕎麥酒中可溶性蛋白質含量。

1.3.3 蕎麥酒中游離氨基酸測定[24]

參照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》中氨基酸測定方法，采用L-8800氨基酸自動分析儀進行測定，儀器進樣時泵1的壓力為2～15 MPa，流速0.4 mL/min；泵2的壓力為0.5～2 MPa，流速0.35 mL/min。

1.3.4 蕎麥酒中總多酚含量測定[25]

分別精確吸取質量濃度為0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液0、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL、1.50 mL，用蒸餾水定容至25 mL，在波長756 nm處測定吸光度值，以沒食子酸溶液質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線。

準確吸取蕎麥酒樣品1 mL，其他條件同建立沒食子酸標準曲線，按照標準曲線計算公式計算樣品中總多酚含量。

1.3.5 蕎麥酒中總黃酮含量測定

參照NYT1295—2007《蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定》，測定樣品中總黃酮含量。

分別吸取蘆丁標準溶液（0.05mg/mL）0.025mL、0.50mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL置于10 mL容量瓶中，加入2 mL 0.1 mol/L三氯化鋁溶液、3 mL 1 mol/L乙酸鉀溶液，用甲醇定容，搖勻，室溫靜置30 min。在波長420 nm處測定吸光度值，以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線。

1.3.6 蕎麥酒中有機酸含量測定

參照GB/T15038—2006《葡萄酒，果酒通用試驗方法》[26]，測定蕎麥酒中的部分有機酸含量，委托貴州省產品質量監督檢驗院（國家酒類及加工食品質量監控檢驗中心）完成。

2 結果與分析

2.1 蕎麥酒中可溶性蛋白質含量

以蒸餾水為空白對照，繪制標準曲線，結果見圖1。得到線性回歸方程：Y=7.618 9x+0.017 9，相關系數R2=0.998 6。

圖1 蛋白質標準曲線Fig.1 Standard curve of protein

通過圖1標準曲線可知，在0～0.1 mg/mL范圍內，牛血清蛋白溶液的質量濃度與吸光度值之間呈現較好的線性關系。在波長595 nm處分別測定3組處理酒樣的吸光度值，結果表明，蕎麥酒中可溶性蛋白質含量為1.23 mg/mL。

2.2 蕎麥酒中游離氨基酸測定結果

2.2.1蕎麥酒中游離氨基酸含量及種類

游離氨基酸是液態法發酵蕎麥酒中重要的營養成分，游離氨基酸含量與蕎麥酒的色、香、味、格都有一定關系。圖2為蕎麥酒中17種游離氨基酸的測定結果，由圖2可知，蕎麥酒中包括7種人體必需氨基酸（纈氨酸（Val）300 mg/L、亮氨酸（Leu）280 mg/L、異亮氨酸（Ile）190 mg/L、蛋氨酸（Met）70 mg/L、苯丙氨酸（Phe）250 mg/L、蘇氨酸（Thr）340 mg/L、賴氨酸（Lys）570 mg/L），2種半必需氨基酸（組氨酸（His）220 mg/L、精氨酸（Arg）930 mg/L）以及8種非必需氨基酸。其中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的23%，谷氨酸是人體內一種重要的營養成分，在治療精神分裂癥、神經衰弱以及肝病方面都具有良好的療效。

圖2 蕎麥酒中游離氨基酸測定結果Fig.2 Determination results of free amino acids in buckwheat wine

2.2.2 蕎麥酒與其他黃酒中游離氨基酸含量對比

蕎麥酒與其他黃酒中游離氨基酸含量對比見表1。從表1可以看出，蕎麥酒中游離氨基酸的含量明顯高于三種市售黃酒產品，其中蕎麥酒中必需氨基酸約占總氨基酸的24.8%，G-H中必需氨基酸約占總氨基酸的32.9%，J-H中必須氨基酸約占總氨基酸的21.5%，蕎麥酒中的必需氨基酸所占總氨基酸比例介于G-H與J-H之間。蕎麥酒中含量最高的是谷氨酸1 860 mg/L，G-H黃酒中含量最高的是脯氨酸471.4 mg/L，T-H黃酒中含量最高的是精氨酸425.5 mg/L，J-H中含量最高的是丙氨酸166.536 mg/L。

表1 蕎麥酒與其他黃酒中游離氨基酸含量對比Table1 Comparison of free amino acids in buckwheat wine and other rice wines

續表

2.3蕎麥酒中總多酚含量測定結果與分析

2.3.1 沒食子酸標準曲線的建立

以蒸餾水空白組作為參比，以沒食子酸質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得到沒食子酸標準曲線回歸方程：Y=5.014x+0.013 4，相關系數R2=0.998 4。表明沒食子酸標準品質量濃度與吸光度值之間呈現良好的線性關系。

2.3.2 蕎麥酒中總多酚含量測定

按上述最優方法測定蕎麥酒中總多酚，平行6次試驗測定，結果見表2。從表2可以看出，測定結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.42%。蕎麥酒中總多酚含量為0.321 2 mg/mL。蕎麥酒中的多酚含量相對豐富且穩定，使得蕎麥酒具有一定的抗氧化能力，多酚對動物和人體內的多種致病病毒的生長都能產生明顯的抑制效果。對于人體軟骨組織的保護與預防骨質疏松、保護眼睛視網膜、防止視力老化都有重要的作用，同時還具有抗菌、消炎等功效，因此蕎麥酒具備良好的保健功能。

表2 蕎麥酒多酚含量測定結果Table2 Determination results of polyphenol content in buckwheat wine

2.4 蕎麥酒中總黃酮含量測定結果與分析

2.4.1 蘆丁標準曲線的建立

以蘆丁質量濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線為Y=27.301x+0.000 2，相關系數R2=0.999 9，在0～0.02 mg/mL范圍內，蘆丁質量濃度與吸光度值之間呈現較好的線性關系。在波長420 nm處分別測定3組處理酒樣的吸光度值，結果表明，蕎麥酒中總黃酮含量為0.122 6 mg/mL。

2.4.2 蕎麥酒中總黃酮含量的測定

按上述最優方法測定蕎麥酒中總黃酮，平行6次試驗測定，結果見表3。從表3可以看出，測定結果的相對標準偏差為0.89%。蕎麥酒中總黃酮含量為0.122 6 mg/mL，重現性良好，總黃酮含量穩定。

表3 蕎麥酒總黃酮含量測定結果Table3 Determination results of total flavonoids in buckwheat wine

2.5 蕎麥酒中主要有機酸測定結果與分析

蕎麥酒的4種主要有機酸測定結果如表4所示，含量最高的是檸檬酸（1.62 g/L），其次是琥珀酸（0.65 g/L），同時還含有蘋果酸以及草酸（0.11g/L），蘋果酸具有抗疲勞、保護肝臟和增強心臟功能的功效。和傳統工藝的黃酒相比，蕎麥酒中草酸的含量和傳統的黃酒相當，檸檬酸、草酸的含量相對豐富，而檸檬酸則具有延緩衰老，消除疲勞等功效，琥珀酸又是導致酒體回味的主要物質，因此在多種有機酸的共同作用下，形成蕎麥酒獨有的風味。

表4 蕎麥酒中主要有機酸測定結果Fig.4 Determination results of main organic acids in buckwheat wine

3 結論

本文分析了蕎麥酒酒體中可溶性蛋白質、游離氨基酸、有機酸、總多酚、總黃酮等營養物質，結果表明，發酵罐釀造蕎麥酒其營養成分豐富，其中蕎麥酒可溶性蛋白含量為1.23 mg/mL，游離氨基酸總量達8 080 mg/mL，明顯高于市售酒G-H、T-H、K-H。總多酚含量為0.321 2 mg/mL；總黃酮含量為0.122 6 mg/mL；4種常見有機酸的含量分別為草酸0.11g/L、蘋果酸0.11g/L、檸檬酸1.62g/L，琥珀酸0.65g/L。

發酵罐液態發酵蕎麥酒使得水溶性營養因子更多的保留在酒中，使其具有更好的保健價值，開拓了蕎麥資源的利用途徑，同時為蕎麥酒工業化生產提供理論依據。