巨大芽孢桿菌L2粗提物的抑菌效果及其抑菌成分分析

吉玉玉，代園鳳，陳 雪，李 祝*，肖 洋，楊 龍，張 素，趙妗頤，張欽語

（1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省煙草公司畢節市公司，貴州 畢節 551700；3.貴州省產品質量監督檢測院，貴州 貴陽 550016）

芽孢桿菌（Bacillussp.）是生物防治中常用的拮抗菌[1]，具有繁殖快速、生命力強、安全無毒等特點，其產生的代謝產物對植物、食品病原微生物防治有重要作用。巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）作為廣譜拮抗菌株針對不同植物及食品細菌病害均具有防治作用[2]，研究報道巨大芽孢桿菌可防治水稻紋枯病[3]、番茄灰霉病[4]、香蕉灰斑病[5]、甘薯黑斑病[5]、棉花立枯病菌[6]、根瘤鐮刀病菌[6]、番茄青枯病菌[7]等。

巨大芽孢桿菌（B.megaterium）L2作為一種植物根系促生細菌[8]，由貴州大學生命科學學院真菌資源研究室分離得到，經前期課題組研究，拮抗菌L2粗代謝物濃度在1.5%～20%時能有效地抑制煙草赤星病菌菌絲生長，平皿培養7 d抑制率在25.3%～74.8%；對病原菌孢子萌發的抑制率隨菌株L2粗代謝物濃度的增高而增高，在10%～50%時培養24 h抑制率為11.4%～87.7%；L2粗代謝物稀釋1～80倍時，對煙草赤星病菌產孢的抑制率在78.2%～18.4%，濃度越高，抑制能力越強[9]，說明拮抗菌L2可能產生某些活性物質來抑制病原菌的生長，進而控制植物病害的發展。課題組對其生防機制也進行了初步探究，發現經含菌量為1.5×1010CFU/mL的L2發酵液處理后，離體煙草葉中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性均明顯提高，其中PAL酶活性提高最大，達到對照的兩倍多，而PAL、PPO、POD酶活的提高能有效促進植物防御病害的能力[10-11]。

引起番茄青枯病的病菌青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）是最具侵染力和破壞力的植物病原細菌之一，菌系非常復雜，寄主范圍相當廣泛[12]，不僅可以危害番茄、茄子、辣椒等蔬菜，還可危害花生、香蕉等作物以及一些觀賞植物和草，能導致全球50多個科200種植物感病[13]；根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）引起的果樹根癌病是一種世界范圍的細菌性病害，該病菌可危害93個科，331個屬，643個不同種的植物[14]；胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）所引起的魔芋軟腐病是一種對魔芋種植業造成毀滅性打擊的細菌性病害，是現在魔芋產業發展的主要威脅[15]。

本研究將對巨大芽孢桿菌L2抑菌活性成分進行提取分離，并以青枯雷爾氏菌為指示菌對分離的各組分進行活性追蹤，并對分離到的粗提物組分進行青枯雷爾氏菌、根癌農桿菌及歐文氏菌抑菌活性測定和氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）成分分析，以期為探索巨大芽孢桿菌L2菌體中的活性物質奠定基礎，從中開發出防治番茄青枯病、魔芋軟腐病以及果蔬根癌病等果蔬植物病害的高效抑菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）L2：由貴州大學真菌資源研究所分離，現保藏于中國典型培養物保藏中心（China center for type culture collection，CCTCC），保藏號：CCTCCNO.M2012381。根癌農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）T-37：中國農業科學院土壤肥料研究所。青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）RS-2、胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）EC-1：貴州大學微生物所分離、鑒定并保存。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏（均為生化試劑）：上海盛思生化科技有限公司；氯化鈉、石油醚（沸程60～90℃）、乙酸乙酯、氯仿、甲醇（均為分析純）：重慶川東化工集團公司；柱層析硅膠、硅膠H、柱層析硅膠G、薄層色譜板：青島海洋化工廠；氘代氯仿（分析純）：武漢中科院波譜公司；Sephadex LH-20：瑞典AB公司。

5%濃硫酸乙醇溶液：量取5.1mL98%濃硫酸緩慢多次沿壁加入94.9 mL無水乙醇中，玻璃棒勻速攪拌。

0.8 %磷鉬酸乙醇溶液：稱取0.8 g磷鉬酸與84.2 mL無水乙醇混合溶解，量取15mL98%濃硫酸緩慢多次沿壁加無水乙醇中，玻璃棒勻速攪拌稀釋散熱。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L，瓊脂15～20 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6。121℃高溫滅菌20 min。

營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。121℃高溫滅菌20 min。

營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基：NB培養基中加入瓊脂15～20 g/L。

1.2 儀器與設備

FA2204N電子天平：上海菁海儀器有限公司；SHP-250智能生化培養箱：上海光都儀器設備有限公司；BIOMATE 3S紫外分光光度計：美國Thermo Fisher公司；7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫公司；SFY10-100液體發酵罐：江大科技有限責任公司；WFH-203B三用紫外分析儀：上海精科實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 巨大芽孢桿菌L2菌粉的制備

按照巨大芽孢桿菌L2最佳發酵條件[11]進行發酵，將種子液按照6%（V/V）接種量轉接到裝液量為80 L/400 L的發酵罐中，攪拌速度150 r/min，通氣量1.5 L/min，在30℃條件下培養48 h終止發酵，高速離心取沉淀，60℃條件下減壓濃縮干燥3 h，粉碎成菌粉（過60目篩）備用。

1.3.2 粗提物浸膏的制備

利用乙醇回流提取法[16]得粗提物浸膏：取巨大芽孢桿菌L2菌粉5 000 g和95%乙醇15 L于回流裝置中加熱4 h，溫度為60～100℃，重復3次得菌株L2粗提取液，在旋轉蒸發儀上減壓濃縮至黏稠狀時加少量水溶解（浸膏不再呈黏稠狀即可），加入乙酸乙酯1∶1（V/V）萃取得上層乙酸乙酯萃取液，經減壓濃縮后得到粗提物浸膏（192.3 g）。

1.3.3 粗提物的分離純化

利用硅膠柱層析法[17]分離菌株L2粗提物：取浸膏加乙酸乙酯溶解1∶1（V/V），以1∶1.2（V/V）比例吸附于40～80目硅膠中，水浴揮干乙酸乙酯，不斷攪拌，直至硅膠復為干燥粉末狀，然后在硅膠層析柱上干法上樣，以石油醚、石油醚：乙酸乙酯（100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1（V/V））、乙酸乙酯:甲醇（30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1（V/V））、甲醇梯度洗脫，進行柱層層析分離。以10 L為一個沖柱體系洗脫，分段收集洗脫液，硅膠薄層板以對應洗脫劑為展開劑跟蹤鑒定，合并相同組分得洗脫組分LE1～LE17，以青枯雷爾氏病菌為指示菌對各組分粗提物進行抑菌活性追蹤，以明確其抑菌活性組分的分布。

1.3.4 抑菌活性的測定

根據劉芳等[18]的方法，分別在1 mL的液體培養基中加入10 μL用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制的質量濃度為100 mg/mL的各組分粗提物、等體積的DMSO及用無菌水配制的質量濃度為100 mg/mL的氯霉素（藥物對照），在10%接種量的基礎上接入3種植物病原菌（T-37、RS-2和EC-1），設3個平行，在37℃、120 r/min的條件下進行搖床培養，根據文獻[18]確定最佳培養時長與最適波長，培養最佳時間后取出稀釋4倍在最適波長條件下測定其光密度（OD）值，抑菌率按下式計算：

式中：OD對照為菌株L2菌懸液OD值；OD處理為粗提物處理組的OD值。

1.3.5 粗提物洗脫組分的抑菌效果及其成分分析

粗提物洗脫組分對三種植物病原菌進行抑菌試驗，并計算活性粗提物洗脫組分對3種植物病原菌的半抑制濃度（50 inhibiting concentration，IC50）值；采用GC-MS分析菌株L2粗提物柱層析洗脫組分的化學成分。

氣相色譜條件：色譜柱為AB-INOWAX毛細管柱（30m×0.25 μm×0.25 mm），載氣為高純氦氣（He）（99.999%），載氣流量1.0 mL/min；汽化室溫度250℃；毛細管程序升溫，初始溫度50℃（保持2 min），以5℃/min升溫至240℃后，保持15 min，運行時間55 min；柱前壓7.65 psi，不分流，溶劑延遲時間：5.0 min；進樣量1 μL。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量70 eV；電子倍增器電壓1 624 V；離子源溫度230℃；GC-MS接口溫度280℃；四極桿溫度150℃；發射電流34.6μA；質量范圍29～500 amu。

1.3.6 數據統計

應用Excel進行數據整理，IBM SPSS Statistics 22進行Probit Regression分析，所得結果用IC50±標準差（standard deviation，SD）表示，并利用IBM SPSS Statistics 22進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 粗提物的分離與抑菌活性追蹤

2.1.1 粗提物洗脫組分抑菌活性追蹤

以乙醇回流提取法與硅膠柱層析法對巨大芽孢桿菌L2活性粗提物浸膏進行提取、分離純化，通過薄層層析（thin layer chromatography，TLC），5%濃硫酸乙醇溶液和0.8%磷鉬酸乙醇溶液110℃加熱顯色至出現顏色清晰的斑點，初步分離合并獲得17段樣品，分別為LE1～LE17。洗脫組分活性追蹤結果如圖1所示，洗脫組分LE4、LE5、LE6、LE7、LE11、LE12在1 mg/mL質量濃度下抑菌率均在50%以上，對病原菌青枯雷爾氏菌RS-2均有較強的抑制作用，其中洗脫組分LE4與LE7的抑菌率最高，分別為79.54%、82.61%。因LE7組分中活性成分經TLC層析色譜分析比洗脫組分LE4復雜，不易進行下一步分離，而洗脫組分LE4組分極性適中，成點性好，因此考慮到實際操作原因，選擇洗脫組分LE4組分繼續進行硅膠柱層析分離。

圖1 菌株L2洗脫組分LE1-LE17對青枯雷爾氏菌RS-2抑菌率的影響Fig.1 Effect of eluant components LE1-LE17 of strain L2 on antibacterial rate ofRalstonia solanacearumRS-2

2.1.2 粗提物洗脫組分LE4抑菌活性追蹤

依據活性追蹤對洗脫組分LE4進行硅膠柱層析分離，分析在波長254 nm紫外條件下觀察薄層層析情況及5%濃硫酸乙醇溶液和0.8%磷鉬酸乙醇溶液110℃加熱顯色情況，合并相同的主點獲得7段樣品，分別為組分LE4-1～LE4-7。7段樣品抑菌活性追蹤結果如圖2所示，組分LE4-1、LE4-2、LE4-6、LE4-7在質量濃度1 mg/mL條件下對病原菌RS-2未有明顯抑制作用，組分LE4-3、LE4-5在此濃度下對RS-2有較強的抑制作用，其中組分LE4-5的抑菌率最高，達到了80.84%，表明菌株L2菌體細胞中的抑菌活性物質主要在粗提物組分LE4-5中。

圖2 菌株L2洗脫組分LE4對青枯雷爾氏菌RS-2抑菌率的影響Fig.2 Effect of eluant components LE4 of strain L2 on antibacterial rate ofRalstonia solanacearumRS-2

2.2 LE4-5抑菌效果及其成分分析

2.2.1 LE4-5抑菌率測定

選用3種植物病原菌（RS-2、T-37、EC-1）利用測OD值法對洗脫組分LE4-5進行抑菌率測定，觀察其抗菌效果，LE4-5對3種植物病原菌的抑菌試驗結果見圖3。由圖3可知，粗提物洗脫組分LE4-5在質量濃度1.2 mg/mL條件下對3種植物病原菌的抑制作用不盡相同，對胡蘿卜軟腐歐文氏菌EC-1有輕微抑制，抑菌率為20.83%；對根癌農桿菌T-37具有較好的抑菌作用，在質量濃度1.4 mg/mL下抑菌率達到最高，為59.58%，IC50值為（1.215±0.078）mg/mL；對青枯雷爾氏菌RS-2抑菌率最高，達到91.04%，IC50值為（0.512±0.056）mg/mL，具有較強的抑制作用。粗提物洗脫組分LE4-5能夠有效抑制RS-2病菌和T-37病菌的生長，并隨其質量濃度的增加，抑菌效果顯著增加（P＜0.05），可見粗提物洗脫組分LE4-5對番茄青枯病菌與果樹根癌病菌具有較好的拮抗效果，尤其是對番茄青枯病具有較強的抑制作用。

圖3 洗脫組分LE4-5對菌株RS-2、T-37、EC-1抑菌率的影響Fig.3 Effect of eluant components LE4-5 on antibacterial rate of strains RS-2,T-37 and EC-1

2.2.2 洗脫組分GC-MS成分分析

粗提物洗脫組分LE4-5的化學組成GC-MS測定的總離子流圖見圖4。對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist2005和Wiley275標準質譜圖，確定了LE4-5的化學成分，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對含量，結果見表1。由表1可知，洗脫組分LE4-5中共檢測到27種脂肪酸成分，主要含有亞油酸（linoleic acid）、亞油酸甲酯（methyllinoleate）、十五烷酸（pentadecanoicacid）、油酸（oleicacid）等，其中，不飽和脂肪酸相對含量達70.686%，以亞油酸（23.607%）、亞油酸甲酯（14.444%）、油酸（4.337%）為主；飽和脂肪酸相對含量為19.274%，以十五烷酸（5.182%）、12-甲基十四烷酸（5.099%）、軟脂酸（5.011%）為主。

圖4 洗脫組分LE4-5化學成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.4 Total ions chromatogram of chemical constitution of eluant components LE4-5 analysis by GC-MS

表1 洗脫組分LE4-5化學成分GC-MS分析結果Table1 Results of chemical constitution of eluant components LE4-5 analysis by GC-MS

2.3 討論

脂肪酸及其衍生物是天然、高效食品抑菌劑的重要來源[19]，其中大部分被美國食品及藥品管理局（food and drug administration，FDA）認證為一般公認安全（generally recognized as safe，GRAS），可作為食品添加劑允許直接添加到食品中[20-21]。以脂肪酸為主體可以衍生出種類繁多的脂肪酸衍生物，主要包括脂肪酸甘油酯、脂肪酸糖酯、脂肪醇、脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯、脂肪酸鹽等[22]。近年來，脂肪酸及其衍生物的抑菌作用受到了人們的廣泛關注。已有研究表明，脂肪酸及其衍生物可抑制絲狀真菌以及酵母菌的生長，比如面包中易染的檜狀青霉、產黃青霉、紅曲霉以及常見的黑曲霉、婁地青霉、詹森青霉、白色念珠菌、釀酒酵母等[23-25]。SUN C Q等[26]比較了脂肪酸及其甘油單酯對幽門螺旋桿菌（慢性胃炎及胃潰瘍的致病菌）的抑菌效果，發現月桂酸是最有效的飽和脂肪酸，油酸和亞麻酸是最有效的不飽和脂肪酸；張希等[27]研究發現，在以大腸桿菌與白色念珠菌為指示菌時，油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸的抑菌活性分別高于碳鏈長度相同的硬脂酸、花生酸等飽和脂肪酸，脂肪酸甲酯、乙酯對供試菌抑制效果較差，但同碳鏈長度的脂肪酸乙酯抑菌活性強于甲酯；KELSEY J A等[28]研究了各種脂肪酸及其甘油單酯對金黃色葡萄球菌（肉制品中致病菌）的抑制效果，結果表明肉豆蔻酸、棕櫚酸、亞油酸的甘油單酯對金葡球菌有一定的抑制作用；WAITERS D等[29]研究發現，亞油酸能有效地抑制終極腐霉菌、立枯絲核菌、燕麥葉炫菌、可可叢枝病菌（植物病害菌）的生長。

3 結論

本試驗通過對巨大芽孢桿菌L2菌體乙酸乙酯部位的化學成分進行初步提取、分離，結合活性追蹤、抑菌率測定和GC-MS分析，探究了具有較強抑菌活性的粗提物洗脫成分LE4-5中的化學成分。活性粗提物LE4-5對胡蘿卜軟腐歐文氏菌EC-1、根癌農桿菌T-37、青枯雷爾氏菌RS-2的抑菌率分別為23.83%、59.58%、91.04%，對RS-2病菌和T-37病菌的IC50值分別為（0.512±0.056）mg/mL和（1.215±0.078）mg/mL。GC-MS分析其主要成分為亞油酸、亞油酸甲酯、油酸等，其中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸分別達到總脂肪酸的70.686%和19.274%，以不飽和脂肪酸為主。菌株L2粗提物LE4-5對兩種食品植物病原菌株RS-2和T-37均有較好的抑菌效果，可推測不飽和脂肪酸類成分與其抑菌有效性密切相關，可能是其主要的藥效物質基礎。