響應面法優化香菇柄酒精發酵工藝

魏書信，劉麗娜，崔國梅，許方方，李順峰，田廣瑞

（河南省農業科學院 農副產品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

香菇（Lentinus edodes）富含蛋白質、膳食纖維、鈣、鐵等多種營養素[1]。香菇柄是香菇商品化整理的副產物，約為菇體總質量的25%[2]，基本營養成分和菇傘部分相近[3]，但其膳食纖維含量顯著高于菇傘，其總膳食纖維高達49.04%[4-5]，直接做菜品適口性較差，堅韌難嚼，這一特性限制了香菇柄食品的大力開發[6-7]。

科技人員針對香菇柄食品研發進行了許多嘗試，開發出諸如香菇柄素蹄[8]、香菇松[9]、香菇醬等產品[10]。但這些產品基本都是用雙剪香菇柄為原料加工的，且消耗的香菇柄數量有限，而大量的單剪香菇柄，尤其是品相稍差的單剪香菇柄，因為價值較低得不到有效重視，許多香菇柄因沒有及時干制或貯藏不當而腐爛被廢棄，而雙剪香菇柄根更是幾乎全部廢棄，造成資源的嚴重浪費。

以香菇為原料發酵制酒的研究偶見報道[11-12]，而以香菇柄根為原料發酵制酒的研究還鮮有報導。該實驗基于實用性考慮，以廉價的香菇柄根為原料，通過Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和響應面試驗，優化香菇柄根酒精發酵工藝，以期為香菇柄根酒類產品研發和香菇柄的完全利用提供一定的數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇柄根：市售帶柄根香菇，雙剪取末段帶根的香菇柄，烘干備用；釀酒曲（食品級）：安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、磷酸二氫鉀、檸檬酸、氫氧化鈉（均為食品級）：市售。

1.2 儀器與設備

GZX-9240MBE電熱鼓風干燥箱、BSC恒溫恒濕箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HK-08A流水式中藥粉碎機：廣州市旭朗機械設備有限公司；FE20-K實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BPMJ-250F霉菌培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；酒精計：河北省冀州市耀華玻璃儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 香菇柄根預處理

干香菇柄根原料置于干燥箱內85℃烘烤45 min，冷卻粉碎為60目的細粉，裝袋備用。

1.3.2 香菇柄根酒精發酵工藝流程

酵母增殖、發酵的基本營養物質為氮源、碳源、核苷酸、維生素、微量元素等，磷（P）是構成酵母菌體中核酸的重要成分，鉀（K）可以促進酵母細胞的增大[13-14]，而適當的pH值是酵母酶系統正常發揮作用的必要條件[10]。香菇柄根粉中含有豐富的蛋白質、游離氨基酸等氮源和核苷酸、維生素、微量元素等，但能被酵母利用的糖類缺乏。因此該試驗的營養配方設計為在香菇柄根粉的基礎上外加葡萄糖和磷酸二氫鉀[15]，并適當調節pH值。

基礎發酵液由香菇柄根粉、磷酸二氫鉀和純凈水組成，按照實驗設計定量稱取香菇柄根粉、磷酸二氫鉀和純凈水，攪拌混合均勻配成基礎發酵液，再按試驗設計向基礎發酵液中添加一定的葡萄糖，完全溶解后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液和50%的檸檬酸溶液調節pH值至實驗設定值，100℃、30 min滅菌，冷卻至32℃左右接種酒曲，在試驗設定溫度條件下恒溫培養，培養期間早晚各勻漿一次。發酵至實驗設定時間即取出，4 800 r/min離心15 min固液分離，上清液即為香菇柄酒精發酵液。

1.3.3 酒精度測定

取100 mL香菇柄酒精發酵液置于1 000 mL蒸餾瓶中，加入100 mL蒸餾水，蒸餾出100 mL溶液，用酒精比重計測定蒸餾液的酒精度，同時用溫度計測定溶液溫度，根據《酒精計溫度濃度換算表》換算成20℃時的酒精體積分數（%）即為酒精度。

1.3.4 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman試驗能僅用兩個水平，通過較少試驗次數從多因素中選出影響顯著的因素[16-18]。采用Plackett-Burman試驗對影響酒精發酵的8個因素（原料粉碎度、香菇柄根粉用量、磷酸二氫鉀用量、葡萄糖添加量、初始pH值、釀酒曲接種量、發酵溫度、發酵時間）進行顯著性篩選。試驗設計因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平Table1 Factors and levels of Plackett-Burman tests

續表

1.3.5 最陡爬坡試驗[19-20]

基于Plackett-Burman試驗篩選出的3個顯著因素進行最陡爬坡試驗設計。根據效應值的正負確定因素爬坡方向，基于效應值大小和實際情況設計因素步長。其他因素水平按照Plackett-Burman試驗結果各因素的正負效應進行確定，效應值為正數取水平高值而負數取低值。以酒精度為考核指標確定因素的最適范圍。

1.3.6 香菇柄根酒精發酵工藝響應面優化試驗

基于Plackett-Burman和最陡爬坡試驗結果，以酒精度（Y）為響應值，利用Box-Behnken進行工藝優化試驗設計。根據響應面法建立的數學模型，分析、預測出香菇柄根酒精發酵最佳工藝條件，再結合儀器的精確度和操作便利性進一步優化工藝。對優化確定的工藝進行驗證試驗，對酒精發酵液和蒸餾液進行初步的品評。

1.3.7 數據處理

Plackett-Burman試驗采用Minitab16設計分析；響應面優化試驗采用Design-Expert 8.0.6設計軟件分析；試驗均做3次重復取平均值，除驗證試驗外均保留一位小數，顯著性采用SPSS 22.0分析。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗結果

在預試驗的基礎上，選取與香菇柄根酒精發酵工藝相關的8個因素，采用Minitab 16中的Plackett-Burman設計，取N=12，C、F、J為虛擬變量，試驗設計與結果見表2，Design-Expert 8.0.6設計軟件進行數據分析，結果見表3。

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果Table2 Design and results of Plackett-Burman tests

表3 Plackett-Burman試驗設計各因素效應分析Table3 Effect analysis of each factors of Plackett-Burman experimental design

由表3可知，由P值大小可知，各因素對酒精度的影響大小順序為香菇柄根粉用量＞發酵溫度＞初始pH值＞磷酸二氫鉀用量＞釀酒曲接種量＞原料粉碎度＞發酵時間＞葡萄糖添加量，其中香菇柄根粉用量、發酵溫度和初始pH值3個因素對酒精度的影響重要性排列居前3位，因此需要進一步對這3個因素進行最陡爬坡試驗。

2.2 最陡爬坡試驗結果

應用Plackett-Burman試驗篩選出的3個顯著因素（香菇柄根粉用量、發酵溫度和初始pH值）進行最陡爬坡試驗。其他因素水平按照效應值正數取高值負數取低值的原則，固定為原料粉碎度60目，磷酸二氫鉀用量0.15%，葡萄糖添加量22%，釀酒曲接種量0.3%，發酵時間72 h。試驗設計和結果見表4。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table4 Design and results of the steepest ascent tests

由表4可知，香菇柄根粉用量、發酵溫度和初始pH值在第3組試驗附近取值時，酒精度最高。因此，選取這一組試驗作為中心組合試驗設計的中心點，進行響應面試驗。

2.3 香菇柄根酒精發酵工藝響應面優化試驗結果

2.3.1 Box-Behnken試驗設計結果與分析

在最陡爬坡試驗結果的基礎上，在固定原料粉碎度60目，磷酸二氫鉀用量0.15%，葡萄糖添加量22%，釀酒曲接種量0.3%，發酵時間72h的條件下，以香菇柄根粉用量（A）、發酵溫度（B）、初始pH值（C）為響應因子，以發酵液酒精度（Y）為響應值，根據Box-Behnken設計3因素3水平優化試驗，試驗設計與結果見表5，響應面二次模型方差分析見表6。

表5 Box-Behnken試驗設計與結果Table5 Design and results of Box-Behnken tests

表6 回歸模型的方差分析Table6 Variance analysis of regression model

利用Design Expert分析軟件進行回歸分析，得到酒精度對香菇柄根粉用量、發酵溫度、初始pH值的二次回歸模型方程：

由表6可知，模型P=0.000 2＜0.01，表明該模型極顯著；一次項A、C，交互項AB、BC，二次項A2、B2對酒精度的影響極顯著（P＜0.01）；二次項C2對酒精度的影響顯著（P＜0.05）；失擬項P=0.129 3＞0.05，影響不顯著，說明回歸方程具有顯著性，模型能較好分析和預測響應值；決定系數R2=0.970 2，說明模型的擬合性較好，調整決定系數0.931 9，說明利用該模型能解釋93.19%響應值的變化，表明該模型可信度高。

2.3.2 響應面分析

響應面圖能直觀地反應各因素與響應值之間的關系以及兩因素之間的交互作用對響應值的影響[21]。根據回歸方程做出各因素交互作用對酒精度影響的響應面及等高線，結果見圖1。

圖1 各因素交互作用對酒精度影響的響應面與等高線Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on alcohol content

由圖1可知，香菇柄根粉和發酵溫度對酒精度響應面坡度較陡，說明兩因素交互作用顯著[22]；香菇柄根粉用量在1.5%～3.0%范圍內時，隨著用量的增加，響應值酒精度快速增長，但當用量過高時，可能過多的香菇柄根粉使發酵液粘度增大，進而影響酵母菌對其他營養物質的吸收利用，導致酒精度降低；隨著發酵溫度的升高，酒精度呈先增加后降低的趨勢。香菇柄根粉和初始pH對酒精度響應面坡度較為平緩，說明兩因素交互作用不顯著（P＞0.05）[22]；隨著香菇柄根粉用量和初始pH的增加，響應值酒精度呈先增加后降低的趨勢。發酵溫度和初始pH對酒精度響應面坡度較陡，說明兩因素交互作用顯著，分析原因可能是發酵液pH和溫度能協同作用于香菇柄根粉從而影響香菇柄根粉中營養物質的溶出而最終影響酒精的生成；隨著發酵溫度和初始pH的增加，響應值酒精度呈先增加后降低的趨勢。

2.3.3 香菇柄根酒精發酵最佳工藝條件的確定與驗證試驗

根據響應面法建立的數學模型，分析預測出香菇柄根酒精發酵工藝的最佳工藝條件：香菇柄根粉用量3.69%、發酵溫度31.07℃和初始pH7.25，酒精度預測值為11.22%vol。結合儀器的精確度和方便操作性，將最佳工藝條件確定為：香菇柄根粉用量3.7%、發酵溫度31℃和初始pH7.3。在此工藝條件下做3次驗證試驗，發酵液平均酒精度為11.32%vol，與預測值相差0.88%，驗證值接近模型預測值，說明新建模型能較好地預測香菇柄根酒精發酵工藝的酒精度，表明響應面法優化香菇柄根酒精發酵工藝是可行的。

3 結論

以廢棄香菇柄根為主料，通過Plackett-Burman試驗分析得出各因素對酒精度的影響大小為：香菇柄根粉用量＞發酵溫度＞初始pH值＞磷酸二氫鉀用量＞釀酒曲接種量＞原料粉碎度＞發酵時間＞葡萄糖添加量。在此基礎上通過最陡爬坡試驗、響應面工藝優化試驗最終優化確定出香菇柄根酒精發酵最佳工藝條件為：香菇柄根粉用量3.7%、發酵溫度31℃和初始pH值為7.3，原料粉碎度60目，磷酸二氫鉀用量0.15%，葡萄糖添加量22%，釀酒曲接種量0.3%，發酵時間72 h。該工藝驗證試驗結果為發酵液酒精度達11.32%vol，比模型預測值11.22%vol高0.88%，說明響應面法可以用于香菇柄根酒精發酵工藝的優化。在此優化條件下得到的香菇柄根粉酒精發酵液和蒸餾液均具有香菇的特殊芳香、口感圓潤余味悠長，為香菇柄根廢料發酵制備酒精類產品提供一定的理論支持。