功能性紅曲發酵條件的優化

李同樂，劉秀河*，顏 麗

（齊魯工業大學（山東省科學院），山東 濟南 250000）

紅曲霉（Monascus）是三囊菌目的曲霉科紅曲霉屬腐生真菌，在我國已有上千年的應用歷史[1]。紅曲米是以大米為原料，使用紅曲霉發酵生產而來的紅色米粒，又被稱為紅曲、赤曲、紅米。近些年來，人們發現紅曲產品對高血壓、高血脂具有良好的治療效果。紅曲在發酵過程中能產生多種代謝產物，其中莫那可林K（Monacolin K）是主要的降脂因子[2]。莫那可林K對膽固醇的合成具有抑制作用，這是由于莫那可林K的結構與3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的結構相似，對3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶具有了競爭性抑制作用，從而能抑制膽固醇的合成[3]，且并無明顯毒副作用[4]。

目前我國生產的紅曲米中莫那可林K的含量一般為8 mg/g左右，因此使用高產莫那可林K菌株，先通過單因素試驗確定了7個紅曲霉發酵的影響因素的大致范圍，進而通過正交試驗確定紅曲米發酵的最佳條件，以提高紅曲米中莫那可林K的產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲霉（紅色紅曲種）K10403：山東中惠生物科技股份有限公司；莫那可林標準品：美國Sigma公司；大米、麩皮、馬鈴薯、豆粕：市售；蛋白胨、葡萄糖、玉米漿、麥芽糖、丙三醇、可溶性淀粉、蔗糖、硝酸鈉、硝酸銨、酵母粉、乳酸、氫氧化鈉、瓊脂：北京奧博星科技有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

斜面培養基[5]：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%，121℃滅菌20 min。

種子培養基：蛋白胨0.4%，大米粉4%，豆粕1%，硝酸鈉0.3%，丙三醇3%，pH 4.4，121℃滅菌20 min。

固態發酵培養基：大米50%，麩皮5%，甘油3.5%，蛋白胨1.5%，初始含水量40%，pH5，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

HNY-2102C恒溫培養振蕩器：天津歐諾儀器股份有限公司；TDL-40B離心機：上海安亭科學儀器廠；KS-080數顯式超聲清洗儀：潔康洗凈電器有限公司；LC-15C高效液相色譜：日本島津有限公司；SW-CJ-2G超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SHB-III循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；BSY-200T高速粉碎機：溪岸五金藥具廠；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉發酵生產莫那可林K工藝流程及操作要點

將紅曲霉的孢子從斜面上刮下至于無菌水中，制備孢子懸浮液，并稀釋至5.7×103個/mL。將15%孢子懸浮液接種到200mL種子培養基上[6]。將種子液在30℃條件下160 r/min搖床培養36h。將三角瓶中的種子液按照一定的接種量接種到裝有固體發酵培養基的500mL培養容器中，低溫發酵3d，高溫發酵15d。將發酵18d的紅曲米置于50℃烘箱中烘干。

1.3.2 種子液條件的優化

菌種的生長曲線及種齡的確定：配制種子培養基，30℃恒溫培養，定時取樣測定干質量，確定種子液中菌體的生長狀況。

1.3.3 單因素試驗

發酵溫度對莫那可林K產量的影響：用固體發酵培養基進行搖瓶發酵，分別選擇恒溫發酵（恒溫26℃、28℃、30℃、32℃）18 d和變溫發酵（前3 d 30℃、后15 d 26℃）[7]。測定紅曲米中莫那可林K的含量，考察不同溫度對莫那可林K產量的影響。

發酵時間對莫納可林K產量的影響：用固體發酵培養基進行搖瓶發酵，每24 h取樣一次，測定紅曲米中莫那可林K的含量，考察發酵時間對莫那可林K產量的影響。

初始含水量的影響：在保持其他因素不變的前提下，分別考察固體發酵培養的含水量20%、30%、40%、50%、60%對莫那可林K產量的影響。

不同碳源及其含量的影響：分別以3.5%的葡萄糖[8]、麥芽糖[9]、蔗糖[10]、可溶性淀粉[11]替代初始培養基中的甘油，以初始培養基作為對照；分別向固體發酵培養基中添加2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的葡萄糖，以初始培養基作為對照，考察發酵培養基碳源種類及其含量對莫那可林K產量的影響。

不同氮源及其含量的影響：分別以1.5%的玉米漿[12]、酵母粉[13]、硝酸銨、硝酸鈉[14]替代初始培養基中的蛋白胨，以初始培養基作為對照；分別向固體發酵培養基中添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的蛋白胨，以初始培養基作為對照，考察發酵培養基氮源種類及其含量對莫那可林K產量的影響。

不同初始pH值的影響：使用乳酸[15]調節固體發酵培養基初始pH值分別為4、5、6、7、8、9，考察發酵培養基初始pH值對莫那可林K產量的影響。

麩皮添加量的影響：在保持其他因素不變的前提下，分別考察固體發酵培養基麩皮含量2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%對莫那可林K產量的影響[16]。

1.3.4 正交試驗優化紅曲霉產莫那可林K

根據單因素試驗試驗結果，以莫那可林K產量為評價指標，選取培養基初始pH值（A）、初始含水量（B）、葡萄糖含量（C）、蛋白胨含量（D）4個因素進行L（934）的正交試驗，因素及水平見表1。

表1 紅曲霉產莫那可林K條件優化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for Monacolin K production byMonascus

1.3.5 莫那可林K含量的測定方法

樣品處理：將紅曲米粉碎過40目篩，稱取400～600 mg樣品至50 mL容量瓶中，用體積分數75%的乙醇定容提取，將提取物過0.45 μm濾膜后采用高效液相色譜對提取的莫那可林K的含量進行測定。

色譜條件：KromasilC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇∶水∶磷酸=385∶115∶0.14（V/V）；柱溫20～25 ℃；進樣量20 μL；流量1 mL/min；紫外檢測波長238 nm[17]。

莫那可林K含量的計算公式如下：

式中：X為莫那可林K的含量，mg/g；h1、h2為樣品中莫納可林K的峰面積；c為莫那可林標準液的質量濃度，μg/mL；50為定容體積，mL；h3為莫那可林標準品的峰面積；m為樣品稱取質量，g。

2 結果與分析

2.1 種子液培養時間的選擇

圖1 種子生長曲線Fig.1 The growth curve of seeds

由圖1可知，培養36 h時為菌體的對數生長期，是接種的最佳時期。培養時間過短，菌種量少、生長緩慢；培養時間過長，菌種衰老，不利于莫那可林K的生產。因此選擇培養時間為36 h。

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 發酵溫度對莫那可林K產量的影響

溫度是影響紅曲霉的生長和莫納可林K的產量，尋找適合紅曲霉生長和代謝產物合成的溫度至關重要[18]。由圖2可知，變溫發酵的紅曲米中莫那可林K含量為10.48 mg/g，明顯高于恒溫培養的紅曲米莫那可林K含量。因此選擇變溫發酵（前3 d 30℃、后15 d 26℃）。

圖2 不同發酵溫度對莫那可林K產量的影響Fig.2 Effects of different fermentation temperatures on the yield of Monacolin K

2.2.2 發酵時間對莫那可林產量K的影響

由圖3可知，發酵初期莫那可林K含量增長較慢，從第8天開始莫那可林K含量快速增長，第18天時發酵產物莫那可林含量最高，為10.68 mg/g，18 d以后莫那可林K含量開始降低。因此選擇最佳發酵時間為18 d。

圖3 不同發酵時間對莫那可林K產量的影響Fig.3 Effects of different fermentation time on the yield of Monacolin K

2.2.3 初始含水量對莫那可林K產量的影響

由表2可知，當固體發酵培養基初始含水量過少時，不能為紅曲霉的生長提供足夠的水分；隨著含水量的增加，莫那可林K含量也增加，初始含水量為40%時，莫那可林K含量最高，為8.24 mg/g；當含水量過高時，培養基中的游離水增加，不利于紅曲霉對氧氣的吸收，莫那可林產量隨初始含水量的增加而降低[19]。因此選擇固體發酵培養基的初始含水量為40%。

表2 不同初始含水量對Monacolin K含量的影響Table2 Effects of different initial water content on the yield of Monacolin K

2.2.4 不同碳源及其含量對莫那可林K產量的影響

由圖4a可知，葡萄糖作為培養基碳源時，紅曲米中莫那可林K含量高于其他碳源，總體上碳源結構越簡單，對于紅曲米中莫那可林K含量的提高效果越明顯。這是由于紅曲霉可以將多糖轉化為可以利用的單糖[20]，但是在發酵初期菌種量少，淀粉酶的活力低，碳源無法滿足紅曲霉生長代謝的需要。由圖4b可知，當葡萄糖添加量為3.0%時莫那可林K含量最高，為11.19 mg/g。因此選擇培養基的碳源為3.0%葡萄糖。

圖4 不同碳源（a）及葡萄糖添加量（b）對莫那可林產量的影響Fig.4 Effects of different carbon sources(a)and addition of glucose(b)on the yield of Monacolin K

2.2.5 不同氮源及其含量對莫那可林K產量的影響

由圖5a可知，蛋白胨作為培養基氮源時，紅曲米中莫那可林K的產量最高。有機氮源作為附加氮源比無機氮源作為附加氮源對于莫那可林K的生產更加有利，可能是由于有機氮源中含有紅曲霉所需的必需氨基酸[21]。由圖5b可知，當蛋白胨的含量為1.5%時莫那可林K含量最高，為13.14 mg/g。因此選擇培養基的氮源為1.5%蛋白胨。

圖5 不同氮源（a）及蛋白胨添加量（b）對莫那可林產量的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources(a)and addition of peptone(b)on the yield of Monacolin K

2.2.6 不同初始pH值對莫納可林K產量的影響

由圖6可知，紅曲米中莫那可林K含量隨初始pH值的升高呈先增加后加少的趨勢，初始pH值為5時，紅曲米中莫那可林K含量最高，為11.44 mg/g，當pH＞5時莫那可林K含量隨pH值的升高而降低。酸性條件比堿性更適合紅曲霉的生長和莫納可林K的生產，紅曲霉是一種嗜酸菌[22]。因此選擇培養基的初始pH值為5。

圖6 不同初始pH對莫那可林K產量的影響Fig.6 Effects different initial pH values on the yield of Monacolin K

2.2.7 麩皮含量對莫納可林產量K的影響

由圖7可知，紅曲米的莫那可林K含量隨麩皮含量的增加呈先增加后減少的趨勢，當麩皮含量為7.5%時莫那可林K的產量最高，為11.27 mg/g；當麩皮含量＞7.5%時莫那可林K含量隨麩皮含量的升高而降低。在基礎培養基里添加一定量的麩皮可以起到支撐培養基的作用，通過提高培養基通透性、減少培養基中的游離水以提高莫那可林K的產量。因此選擇培養基的麩皮含量為7.5%。

圖7 不同麩皮含量對莫那可林K產量的影響Fig.7 Effects of different bran content on the yield of Monacolin K

2.3 正交試驗結果分析

由表3可知，對紅曲霉產莫那可林K的影響依次為B＞D＞C＞A，即初始含水量是影響固體發酵的最重要因素。最佳發酵條件組合為A2B3C1D2，即初始含水量50%、蛋白胨含量1.5%、葡萄糖含量2.5%、初始pH值5。在最佳條件下進行3組驗證試驗，紅曲米中莫那可林含量為14.22 mg/g。

表3 紅曲霉產莫那可林K條件優化正交試驗結果與分析Table3 Results and analysis of orthogonal experiments for Monacolin K yield byMonascus

由表4可知，初始加水量對紅曲米中莫那可林K的含量有顯著影響（P＜0.05），其他因素不顯著（P＞0.05）。

表4 正交試驗結果方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal experiments results

3 結論

在單因素試驗的基礎上，采用正交優化試驗對紅曲霉發酵條件進行優化，獲得紅曲霉的最佳培養培養基組成是大米38.5%、麩皮7.5%、蛋白胨1.5%、葡萄糖2.5%、初始含水量50%，最佳培養條件為初始pH 5、30℃培養3 d轉入26℃培養15 d。在此優化條件下，發酵的紅曲米中莫那可林K含量為14.05 mg/g。