遺傳算法優化CGXII培養基提高谷氨酸棒狀桿菌產L-精氨酸

王 震，張 豪，鄭穗平*

（華南理工大學 生物科學與工程學院，廣東 廣州 510006）

L-精氨酸是一種重要的半必需氨基酸，廣泛應用于食品、保健和醫藥工業。L-精氨酸參與多種生理過程，包括刺激激素的分泌，增強傷口愈合和參與一氧化氮的合成[1]。近20年來，提高微生物如谷氨酸棒狀桿菌生產L-精氨酸的能力的方法被廣泛的研究。如利用代謝工程在分子水平對菌株進行通路改造[2]和優化菌株生產環境如培養基、溶氧及pH等[3-4]。

作為菌體生長的介質，培養基的組成對于L-精氨酸的積累有著最基本、不可替代的重要作用，CGXII培養基是一種不含有機氮源的培養基[5]。有機氮源如蛋白胨、酵母膏和黃豆餅中的成分分解可以產生氨基酸等小分子，在谷氨酸棒狀桿菌的生產L-精氨酸的過程中，利用不含有有機氮源的CGXII培養基可以排除有機氮源的干擾。在之前的工作中，以谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC14067為出發菌株，通過改造argB基因（268為組氨酸突變為谷氨酸）和過表達基因argG和argH得到了一株有L-精氨酸生產潛力的菌株ATCC14067-Peftu-argBH268E-argGH（BGH）[6-7]。然而谷氨酸棒狀桿菌BGH在CGXII培養基搖瓶發酵72 h之后，L-精氨酸的積累量僅為0.6 g/L。因此需要進一步優化CGXII培養基的成分配比來提高谷氨酸棒狀桿菌的L-精氨酸積累。

遺傳算法是一種借鑒自然界生物選擇進化思想的優化算法，其應用廣泛，不僅可以求取目標函數的極值[8]，還可以優化水中有毒物質的生物降解過程[9]。遺傳算法也可以應用在培養基優化，其相較于常規培養基優化方法如單因素分析[10]、正交試驗[11]、均勻設計[12]及響應面分析[13]，具有優化范圍廣、優化參數多和搜索速度快的優點[14]，在相同優化水平下，遺傳算法所需的試驗次數可以極大的減少，縮短優化時間，提高優化效率[15]。本試驗通過遺傳算法不斷優化CGXII培養基組分配比，以快速提高谷氨酸棒狀桿菌產L-精氨酸積累。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

谷氨酸棒狀桿菌ATCC14067-Peftu-argBH268E-argGH（BGH）：本實驗室保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖、硫酸銨、尿素、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、氯化鈣、七水硫酸鐵、一水硫酸錳、七水硫酸鋅、無水硫酸銅、六水氯化鎳、原兒茶酸、3-瑪琳丙磺酸（3-morpholinopropanesulfonic acid，MOPs）、碳酸氫鈉、瓊脂糖：廣州普博儀器（紐普諾博生物制品）有限公司；腦心浸液：美國BD公司；2,4-二硝基氟苯（dinitrofluorobenzene，DNFB）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.3 培養基

CGXII初始培養基：葡萄糖40 g/L，硫酸銨20 g/L，尿素5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.25 g/L，氯化鈣10 mg/L，七水硫酸鐵10 mg/L，一水硫酸錳10 mg/L，七水硫酸鋅1 mg/L，無水硫酸銅0.2 mg/L，六水氯化鎳0.02 mg/L，原兒茶酸30 mg/L，MOPs 42 g/L。

腦心浸液瓊脂（brain heart infusion，BHI）固體培養基：腦心浸液37 g/L，瓊脂糖2 g/L。

BHI液體培養基：腦心浸液37 g/L。

1.2 儀器與設備

UV2350型紫外分光光度儀：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀：濟南柏盛生物科技有限公司；5430R離心機：德國Eppendorf公司；Waters e2695高效液相色譜（配備有Waters 2489紫外分光光度計）：沃特世科技（上海）有限公司；GeminiNXC18色譜柱（5 μm×250mm）：廣州菲羅門科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 遺傳算法參數

CGXII培養基包含15種物質成分，其中作為唯一碳源的葡萄糖和作為pH緩沖試劑的MOPs不參與遺傳算法優化。考慮到遺傳算法優化過程中，培養基成分的不同配比會導致菌體新陳代謝速度的改變，進而引起碳源消耗速率的改變，為了避免作為唯一碳源的葡萄糖在發酵后期被消耗殆盡，干擾遺傳算法優化的結果，因此在遺傳優化的整個過程中，把培養基中的葡萄糖質量濃度固定為80 g/L。作為pH緩沖試劑的MOPs固定為42g/L，使用之前用4mol/L的氫氧化鈉調節pH至6.8。

遺傳算法優化中，染色體代表培養基，位于染色體上的基因代表相對應的培養基組分的濃度。遺傳算法優化CGXII培養基分為四個步驟，如圖1所示，第一步是確定優化的培養基物質范圍和優化水平，并隨機創建初始種群，第二步根據初始種群的的適應度函數（本研究設定為72 h的L-精氨酸積累量），選擇優良個體，第三步根據交叉規則，將初始種群所產生的優良個體進行隨機交叉，第四步進行突變操作，增加基因的多樣性。生成種群重復選擇、交叉和突變，直到優化達到瓶頸。

圖1 遺傳算法流程圖Fig.1 Flow chart of genetic algorithm

在本實驗利用遺傳算法優化培養基的設置中，種群大小固定為15，每個個體兩次平行來減少誤差。染色體編碼采用二進制編碼，每個基因的編碼的長度為6位，即染色體總長度為78位。選擇算法采用輪盤賭算法[16]。交叉方式為4基因的異步獨立交叉，交叉概率0.8。突變方式為單點突變，突變概率0.19。

1.3.2 發酵方法

將保存的菌體BGH在BHI固體培養基平板上劃線（根據需要添加25 mg/L的卡那霉素（kanamycin，Kan）抗性），30℃恒溫培養36 h。挑取單菌落，接種至BHI液體培養基，30℃、250r/min培養至OD600nm≈10，轉接至裝有50mLCGXII培養基（遺傳算法生成）的250 mL錐形瓶中，初始OD600nm控制在0.2，為避免BHI培養基干擾試驗結果，轉接之前4 000 r/min離心5 min并棄去上清。在30℃、250 r/min的條件下培養72 h，每隔24 h取樣測量細胞干質量和殘糖，72 h測量L-精氨酸產量。每種培養基兩次平行，減少試驗的隨機誤差。

1.3.3 測定方法

細胞干質量測定：取不同時期的發酵液利用分光光度儀在波長600 nm處檢測吸光度值，同時取10 mL發酵液14 000 r/min離心5 min，棄上清，用0.5 mol/L（NH4）HCO3溶液重選洗滌3次[17]，在110℃烘干至質量恒定并檢測質量，回歸擬合得到細胞干質量（cell dry mass，CDM）與發酵液OD600nm的換算關系，如公式所示：

CDM=0.306 2×OD600nm

殘留葡萄糖濃度測定：利用SBA-40E生物傳感分析儀進行測定殘糖。

氨基酸含量測定：氨基酸的測定依據DNFB衍生法[18]。將菌液離心取上清，樣品稀釋5倍，之后去稀釋后的液體150 μL，加入0.5 mol/L的NaHCO（3pH 9.07）150 μL，再加入DNFB溶液（準確吸取1 mL 2,4-二硝基氟苯，用乙腈定容至100 mL）150 μL。混勻，在暗處60 ℃水浴反應1 h，反應完成后暗處冷卻至室溫，加入1 050 μL的PBS緩沖溶液（pH7.0），暗處靜置10 min，然后14 000 r/min離心10 min以去除雜質，最后用有機濾膜過濾轉移至進樣瓶。標準氨基酸溶液的處理同上。流動相A溶液為0.05 mol/L的乙酸鈉溶液。稱取無水乙酸鈉4.1 g，加入超純水990 mL，調節pH至6.8，再加入N,N-二甲基甲酰胺10 mL。有機濾膜過濾，然后超聲30 min排除氣泡。流動相B溶液是乙腈與水按55∶45（V/V）的體積比配制，流速1 mL/min，檢測溫度30℃，檢測波長360 nm。

2 結果與分析

2.1 遺傳算法的培養基成分優化

CGXII培養基中包含有15種成分，除去作為唯一碳源的葡萄糖和作為pH緩沖試劑的MOPs，剩余的13種培養基成分都參與了本次的遺傳算法優化。在參與遺傳算法優化的13種培養基成分，根據用量的多少，可以劃分為大量成分和微量成分，其中硫酸銨、尿素、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和七水硫酸鎂為大量成分，剩余8種為微量成分。在劃定遺傳算法對于不同的培養基成分的優化范圍時，為了提高優化效率，減少優化步驟，13種培養基成分的優化范圍都依據CGXII初始培養基中各個培養基成分的濃度進行劃定，每種培養基成分的具體優化范圍見表1。優化步長的設置與遺傳算法中個體染色體上的基因長度相關，在表1中同時也給出了遺傳算法的優化步長。本研究中，代表每種培養基的基因長度為6位二進制數字，即個體的染色體（包含參與優化的13種培養基基因）為78位二進制數字。

表1 CGXII培養基成分優化范圍與步長Table1 Range and step size of CGXII medium components optimization

種群大小固定為15，初始種群的生成采用隨機方式，通過1.3方式搖瓶發酵并檢測72 h的L-精氨酸積累量，根據每個個體的精氨酸積累量進行評價并選擇優良個體，常用的選擇算法包括輪盤賭算法，錦標賽算法和隨機遍歷抽樣法，本研究選用了簡潔高效的輪盤賭算法。通過輪盤賭算法得到的優良個體，需進行交叉操作，來混合組成新的個體。交叉操作涉及到交叉概率和交叉基因個數[19-20]，因為本次優化的培養基成分多達13種，為保證基因混合充分，交叉基因個數設定為4，并且4基因的交叉方式為異步獨立交叉，交叉概率設定為0.8。通過選擇和交叉操作所得的新個體，其基因都來自于初始種群，因此初始種群即限定了最終的優化結果，為了增加種群基因的多樣性，引入突變操作，突變概率控制基因多樣性的程度，本研究的突變概率為0.19。通過選擇、交叉和突變生成新一代種群，之后不斷的重復上述過程，直到新生成個體的L-精氨酸產量提升很低或者L-精氨酸積累量減少。

圖2 遺傳算法優化谷氨酸棒狀桿菌發酵過程中L-精氨酸積累情況Fig.2 L-arginine accumulation in the fermentation process byCorynebacterium glutamicumoptimized by genetic algorithm

遺傳算法生成的四代種群搖瓶發酵72 h的L-精氨酸積累值見圖2。精氨酸生產過程中每代種群L-精氨酸產量的平均值和最優值對比見圖3。從圖2可以看出，菌株BGH在CGXII初始培養基（gen_（1～4）-0）發酵72 h后，精L-精氨酸的積累值僅為0.61g/L。而BGH菌株在初代種群的最優個體gen_1-11培養基發酵72h的L-精氨酸積累值達到了1.68g/L，第二代、第三代和第四代種群的最優個體（gen_2-13、gen_3-14、gen_4-7）在同樣條件下的L-精氨酸積累值分別為1.94g/L、2.37g/L、2.12g/L。經過四代遺傳算法優化，得到的最優個體為gen_3-14，BGH在gen_3-14培養基中發酵72 h，L-精氨酸積累值達到2.37 g/L，相較于CGXII初始培養基提高了288.5%。

由圖3可知，雖然在最優個體上第四代種群表現不如第三代種群，但從種群整體來考慮，第四代種群L-精氨酸的平均積累值（1.60 g/L）高于第三代種群L-精氨酸的平均積累值（1.46 g/L）。說明遺傳算法仍在繼續富集優良基因并傳遞到下一代種群。

圖3 發酵過程中每代種群L-精氨酸產量的平均值和最優值對比Fig.3 Comparison of the average and optimal L-arginine production of each generation population in the fermentation process

2.2 遺傳算法優化過程中的生長與碳源消耗分析

圖4 發酵過程中每代種群生物量的平均值和L-精氨酸積累最多個體的生物量對比Fig.4 Comparison of average biomass of each generation population and biomass of the individuals with the highest L-arginine accumulation in the fermentation process

由圖4可知，在0～24 h的時間段內，隨著優化的進行，種群的平均細胞干質量整體為一個下降趨勢，而相對應的24～48h和48～72h的時間段內，種群的平均細胞干質量呈現一種上升趨勢。具體到每代種群的最優個體（圖4中的點線圖），也有類似的生長模式的變化趨勢。

由圖5可知，在0～24 h時間段，葡萄糖的消耗量隨著優化的進行而逐漸降低，24～48 h的時間段內則為增加的趨勢。因為相較于積累代謝產物，菌體快速的生長繁殖過程所消耗的能量更大，圖5的變化趨勢進一步佐證了圖4所示的生長模式的變化趨勢。

這一現象說明，經過遺傳算法優化之后，培養基的組成在發酵的整個過程中，都更有利于菌體保持正常的生理狀態，不會因為代謝副產物的積累影響代謝功能的紊亂進而產生菌體死亡的現象。

圖5 發酵過程中每代種群的葡萄糖消耗量平均值和L-精氨酸積累最多個體葡萄糖消耗量的對比Fig.5 Comparison of average glucose consumption of each generation population and the glucose consumption of individuals with the highest L-arginine accumulation in the fermentation process

2.3 遺傳算法優化過程中優良個體的代謝分析

谷氨酸棒狀桿菌的L-精氨酸代謝簡圖見圖6。代謝圖涉及到了TCA循環上的α-酮戊二酸和草酰乙酸兩個節點（即A、B框）以及糖酵解途徑末端的丙酮酸節點（C框）。谷氨酸棒狀桿菌BGH在遺傳算法所涉及的有代表性4個培養基中分別發酵72 h后的氨基酸對比結果見圖7（a、b和c分別對應代謝簡圖中的A、B和C框內的氨基酸）。

圖6 谷氨酸棒狀桿菌中L-精氨酸的代謝圖Fig.6 Metabolic map of L-arginine inCorynebacterium glutamicum

由圖7a可知，α-酮戊二酸節點上，相較于CGXII-0培養基，谷氨酸棒狀桿菌BGH在另外3種培養基中發酵72 h后的谷氨酸、鳥氨酸、瓜氨酸和L-精氨酸的積累量都提高了，說明CGXII培養基的改變，增強了α-酮戊二酸轉化為L-精氨酸的代謝途徑。另外，培養基優化前后的脯氨酸產量都為0，谷氨酸積累速度的提高對于脯氨酸的代謝并未產生任何影響。由圖7b可知，谷氨酸棒狀桿菌BGH在遺傳算法優化之后的培養基中發酵72 h后，草酸乙酰節點下的天冬氨酸以及以草酸乙酰為前提的賴氨酸，蛋氨酸和異亮氨酸，相較于優化前培養基CGXII-0都有不同程度的提高。然而，在糖酵解途徑末端的丙酮酸節點下的丙氨酸。纈氨酸和亮氨酸，相較于CGXII優化之前，積累量都明顯下降。

圖7 四種培養基的氨基酸代謝對比Fig.7 Comparison of amino acid metabolism in four kinds of media

通過遺傳算法的培養基優化，TCA循環上的α-酮戊二酸和草酰乙酸這兩個節點下的氨基酸的積累量都有所提高，丙酮酸作為糖酵解末端的生成物質，也是TCA循環上的乙酰輔酶A的前提物質，其節點下的氨基酸的積累量都明顯減少。可見，對于谷氨酸棒狀桿菌BGH，遺傳算法優化之后的培養基相較于初始CGXII培養基CGXII-0，可以促進丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，抑制丙酮酸轉化為丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸，增強了TCA循環及相關代謝支路。糖酵解的丙酮酸節點的氨基酸分流減弱和TCA循環增強的代謝水平改變規律，或許可以為L-精氨酸以及其他氨基酸的基因工程育種提供一個很有潛力的方向。

3 結論

通過遺傳算法優化CGXII培養基，得到更有利于谷氨酸棒狀桿菌BGH積累精氨酸的新培養基CGXII-gen_3-14，L-精氨酸產量從0.61g/L提升至2.37g/L。遺傳算法優化之后的培養基，更有利于谷氨酸棒狀桿菌的生長。通過進一步的代謝分析發現，遺傳算法優化的培養基減少丙酮酸支路氨基酸的積累，增強TCA循環的流量，從而使L-精氨酸的產量提高。