甜高粱青貯飼料中乳酸菌最佳添加劑量的探討

李蕎蕎，王曙陽*，董妙音，許富強，陳積紅，3，胡 偉，劉 敬，李文建，3

（1.中國科學(xué)院 近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學(xué)院大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049；3.甘肅省輻照誘變育種工程實驗室，甘肅 武威 733001）

甜高粱作為飼用及糖料作物被長期栽種，營養(yǎng)豐富、生物產(chǎn)量高、用途廣泛、對生長的環(huán)境條件不嚴(yán)格，是解決降低國際畜牧養(yǎng)殖成本的最佳飼料，也是緩解國際能源緊張的生物質(zhì)能[1]。青貯是保存和開發(fā)飼料資源、發(fā)展“節(jié)糧型”畜牧業(yè)的有效手段[2]。青貯后的甜高粱酸甜適宜，牲畜喜歡采食，飼喂奶牛后產(chǎn)奶量增加[3]。添加乳酸菌能增加青貯早期乳酸菌的數(shù)量，迅速降低pH，從而抑制霉菌和其他細(xì)菌的生長繁殖，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)[4]。添加同型乳酸菌可以快速增加乳酸含量，減少蛋白降解和氨基酸態(tài)氮的含量[5]，但同型菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸不足以抑制真菌的繁殖，青貯料開封后，易引起二次發(fā)酵，導(dǎo)致有氧腐敗，而異型乳酸菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生乙酸，乙酸可以抑制真菌，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，結(jié)合二者的優(yōu)勢，添加同型菌和異型菌組成的復(fù)合菌劑，可以獲得最優(yōu)品質(zhì)的青貯飼料[6]。發(fā)酵品質(zhì)的評價主要是考察青貯飼料感官情況、營養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)[7-8]。

目前，飼用型甜高粱在國內(nèi)外大面積推廣種植，市場上青貯菌劑的種類也日益增多，但國內(nèi)甜高粱青貯產(chǎn)業(yè)化研究和與開發(fā)仍處在起始階段，針對甜高粱特性而開發(fā)出的青貯菌劑較少，李俊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，甜高粱青貯成本高于玉米青貯，但飼喂效果優(yōu)于玉米青貯，董妙音等[2]研究發(fā)現(xiàn)，接種自制復(fù)合青貯菌劑FHI可提高甜高粱青貯品質(zhì)。因此，篩選研發(fā)適合甜高粱品種的添加劑，并優(yōu)化出最佳添加量，降低甜高梁青貯成本，對提高甜高粱青貯品質(zhì)及青貯產(chǎn)業(yè)化研究有重要意義。目前對于復(fù)合乳酸菌制劑對甜高粱青貯最佳添加量的優(yōu)化試驗鮮有報道，本研究通過測定分析5組不同添加劑量的自制復(fù)合乳酸菌劑以及美國、臺灣商品青貯菌劑對甜高梁秸稈青貯后的感官評價，營養(yǎng)成分以及發(fā)酵品質(zhì)，綜合評價青貯質(zhì)量，以探討自制復(fù)合乳酸菌劑對甜高梁秸稈青貯的最佳添加量，為自制的青貯菌劑的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青貯原料：甜高梁秸稈，種植于甘肅省武威市近代物理研究所產(chǎn)業(yè)園，收割于2017年10月份。

菌劑：試驗所用的乳酸菌復(fù)合菌劑由中國科學(xué)院近代物理研究所微生物室制備，由Lact1、Lact2、Lact3、Lact4四種乳酸菌按1∶7∶1∶1的比例混合而成，其中Lact1、Lact2、Lact3、Lac4菌株分別為干酪乳桿菌、玉米乳桿菌、布氏乳桿菌、布氏乳桿菌，Lact1、Lact3是從甜高梁秸稈中分離，Lact2、Lac4是從玉米秸稈中分離，均是經(jīng)重離子輻照誘變篩選所得到的高產(chǎn)菌株。自制乳酸菌復(fù)合菌劑活性乳酸菌含量≥10億個/mL；美國青貯菌劑、臺灣青貯菌劑（由多種乳酸菌及酶組成，活性乳酸菌含量≥100億個/g）：臺灣亞芯生物科技有限公司。

葡萄糖：天津市大茂化學(xué)試劑廠；牛肉膏：北京雙旋微生物培養(yǎng)基有限公司；蛋白胨：北京雙旋微生物培養(yǎng)基有限公司；酵母提取物：天津市光復(fù)精細(xì)化工廠；檸檬酸鈉：天津市北辰方正試劑廠；磷酸氫二鉀：天津市恒興化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉：天津市巴斯夫化工有限公司；吐溫-80：上海大眾制藥廠；硫酸鎂：天津市北辰方正試劑廠；硫酸錳：北京雙環(huán)化學(xué)試劑廠；以上試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10酸度計：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SP-756PC紫外-可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；2675高效液相色譜儀：WATERS公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；5417R高速臺式冷凍離心機：德國Kendro公司；06粗纖維測定儀：濟南儀器盛泰有限公司；DL-1萬用電爐：北京科偉永興儀器有限公司；ATN-100凱氏定氮儀：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗方法

甜高粱秸稈人工剪碎至2 cm左右，控制青貯原料含水量為65%～75%，試驗設(shè)8組，自制乳酸菌復(fù)合菌劑添加量0.5mL/kg組、1.0mL/kg組、1.5mL/kg組、2.0mL/kg組、2.5mL/kg組、美國組、臺灣組以及空白對照組（CK），自制復(fù)合菌劑按不同的添加劑量分別稀釋至20 mL，添加至100 g秸稈中，充分混合均勻后，裝填至聚乙烯真空包裝袋中，壓實，封口，空白對照組（CK處理）中噴等量的蒸餾水；美國（1加侖/100t）、臺灣商品菌劑組（20g/t）均按照商品的使用說明加至秸稈中，美國、臺灣接種量分別為0.03785mL/kg、0.02g/kg。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，共24袋，32℃青貯發(fā)酵17 d后，開袋取樣檢測，對飼料進(jìn)行分析評價，比較各組的青貯效果，以選出自制乳酸菌復(fù)合菌劑對甜高粱青貯的最佳添加量。

1.3.2 測定方法

（1）感官評價

根據(jù)農(nóng)業(yè)部頒布的《青貯飼料質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》進(jìn)行感官評價，分別從pH值、水分、氣味、色澤、質(zhì)地等幾個方面進(jìn)行評價，分為優(yōu)、良、中、下四個等級[10]。評價得分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 青貯飼料品質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)Table1 Quality evaluation standards of silage

（2）pH值的測定

開袋取青貯鮮樣10 g于三角瓶中，加入90 mL蒸餾水，4℃冰箱靜置24h，依次用4層紗布和中性定性濾紙過濾，制得浸提液，采用精密pH計測定浸提液pH值[11]。

（3）主要微生物類群數(shù)量分析

微生物數(shù)量采用平板記數(shù)法測定。取青貯鮮樣10g，加90mL滅菌生理鹽水，混合均勻后逐級稀釋至10-7，懸浮液平板涂布，測定乳酸菌、酵母菌及霉菌數(shù)量。乳酸菌采用MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后計數(shù)，酵母菌和霉菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3～5 d后計數(shù)[12]。

（4）青貯后營養(yǎng)成分測定

干物質(zhì)（dry matter，DM）含量的測定采用烘干法[13]；粗纖維、酸性洗滌纖維（aciddetergentfiber，ADF）和中性洗滌纖維（neutraldetergentfiber，NDF）的含量采用范氏（VanSoest）纖維測定法[14]；粗蛋白（crude protein，CP）和總氮含量GB 6432—1994《飼料中粗蛋白測定方法》中的凱氏定氮法測定[15]；總糖采用GB 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》中的斐林試劑熱滴定法測定[16]；采用高效液相色譜儀測定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量[17]。

（5）青貯品質(zhì)評定方法

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《青貯飼料質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)》中，以氨基酸態(tài)氮、有機酸進(jìn)行綜合評定[8（]評定標(biāo)準(zhǔn)見表2～表3）。

表2 青貯飼料中氨基酸態(tài)氮與總氮比值評分標(biāo)準(zhǔn)Table2 Evaluation standards for amino acid nitrogen to total nitrogen ratio in silage

表3 青貯飼料中有機酸含量評分標(biāo)準(zhǔn)Table3 Evaluation standards for organic acid content in silage

此評分標(biāo)準(zhǔn)中，將pH值評分、有機酸評分和氨基酸態(tài)氮的評分相結(jié)合，pH值占25%，有機酸占50%，氨基酸態(tài)氮占25%，按比例相加得綜合得分[8]。綜合得分與青貯飼料質(zhì)量等級關(guān)系如表4所示。

表4 青貯飼料綜合得分與對應(yīng)的質(zhì)量等級Table4 Comprehensive score of silage and corresponding quality grade

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組實驗均做3個平行，采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同乳酸菌劑青貯后對青貯料感官評價的影響

青貯后，對不同乳酸菌添加劑處理的飼料進(jìn)行感官評價，包括水分、pH值、干物質(zhì)、氣味、色澤、質(zhì)地，結(jié)果如表5所示。

表5 不同乳酸菌添加劑處理的青貯飼料感官評價結(jié)果Table5 Sensory evaluation results of silage with different lactic acid bacteria additive

由表5可知，青貯發(fā)酵完成后，除美國組之外，青貯料的感官評價均優(yōu)于對照組。自制復(fù)合乳酸菌劑按不同的劑量添加于甜高梁中青貯后，感官評價均為優(yōu)等。復(fù)合菌劑各組pH較CK組均有降低，0.5 mL/kg組、2 mL/kg組以及1.5 mL/kg組pH較CK組顯著降低（P＜0.05），pH值分別比對照低了0.27、0.27、0.25；各組氣味均為不同程度的甘酸香味，無腐敗霉味，除CK組外，其他各組青貯料為黃色，說明發(fā)酵良好。雖然感官評價能夠?qū)η噘A飼料品質(zhì)進(jìn)行快速直觀的判斷，但感官評價存在主觀性。因此，對青貯飼料的營養(yǎng)成分和發(fā)酵品質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。

2.2 不同乳酸菌添加劑對甜高粱青貯飼料微生物組成的影響

青貯發(fā)酵后，通過平板計數(shù)對飼料中微生物組成進(jìn)行檢測，結(jié)果如表6所示。

表6 不同乳酸菌添加劑對甜高粱青貯微生物組成的影響Table6 Effects of different lactic acid bacteria additive on microbial composition of sweet sorghum silage

青貯飼料中的乳酸菌數(shù)量越多，說明青貯飼料品質(zhì)越好，而青貯飼料中的酵母菌、霉菌數(shù)量越多，說明青貯飼料的品質(zhì)越差，并會引起青貯飼料的二次發(fā)酵[18]。由表6可知，乳酸菌添加劑可以影響甜高梁青貯飼料的微生物組成。青貯發(fā)酵后，乳酸菌數(shù)量均高于CK，以添加量1.5 mL/kg的處理最高，乳酸菌數(shù)量達(dá)到5×1010個/mL，顯著高于CK處理（P＜0.05）；除CK組外，其他組均未檢測到霉菌的存在，說明發(fā)酵品質(zhì)良好；自制復(fù)合乳酸菌劑各添加量組均未檢測出酵母菌的存在，可能是由于自制混合乳酸菌劑中所存在的異型乳酸菌，發(fā)酵除產(chǎn)生乳酸外，還產(chǎn)生乙酸，抑制酵母菌和霉菌，從而提高青貯物的有氧穩(wěn)定性。說明添加自制乳酸菌混合菌劑，有效抑制了酵母菌和霉菌的生長，可以改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。

2.3 不同乳酸菌添加劑對甜高粱青貯飼料營養(yǎng)成分的影響

青貯完成后取樣，測定甜高梁飼料的纖維、粗蛋白、總糖等指標(biāo)，分析不同乳酸菌添加劑對甜高粱青貯飼料營養(yǎng)成分的影響，結(jié)果如表7所示。

由表7可知，甜高梁秸稈青貯完成后，干物質(zhì)含量較CK均存在顯著性差異（P＜0.05）。從粗蛋白含量來看，美國、臺灣、0.5 mL/kg組、1.0 mL/kg組、1.5 mL/kg組粗蛋白含量較CK組有顯著性差異（P＜0.05），1.5 mL/kg組處理的粗蛋白含量最高，較對照高出25.61%，較美國組、臺灣組提高了13.51%、8.91%；美國、臺灣、0.5 mL/kg組、1 mL/kg組分別較對照高出10.65%、15.33%、16.82%、24.30%。

表7 不同乳酸菌添加劑對甜高粱青貯營養(yǎng)成分的影響Table7 Effects of different lactic acid bacteria additive on nutritional components of sweet sorghum silage

飼料中的中性和酸性洗滌纖維含量高會影響動物的采食率和瘤胃消化率[19]。從酸性洗滌纖維含量來看，青貯后其含量較對照均有不同程度的降低，除2.5mL/kg組外，其他各組酸性洗滌纖維含量較對照均有顯著性差異（P＜0.05），1.5 mL/kg組含量最低，為37.09%，比對照降低了38.05%，較美國組、臺灣組分別降低了14.30%、26.09%；1 mL/kg組較對照降低了36.28%；美國、臺灣、2.0 mL/kg組分別比對照降低了27.69%、16.19%、29.33%。從中性洗滌纖維含量來看，各實驗組與對照相比均存在顯著性差異（P＜0.05），其中，美國組中性纖維含量最低，為71.37%，較對照低了10.60%；其他各組之間相差不大，1.5 mL/kg組、1.0 mL/kg組分別較對照低了7.28%、8.13%，2.5 mL/kg組、2.0 mL/kg組分別較對照低了5.60%、6.04%。

總糖是影響飼料青貯效果的一個重要因素，因此在適宜的條件下，總糖含量越高，發(fā)酵過程中乳酸菌活動更活躍[13]。從各處理組的總糖含量來看，在添加青貯菌劑青貯后，總糖含量的下降速率減緩，使得青貯飼料中的養(yǎng)分得以有效保存，從而提高了飼料的青貯品質(zhì)。添加量為1.5mL/kg組和0.5 mL/kg組的總糖含量顯著高于對照組（P＜0.05），分別較對照高出18.18%、17.57%；1.5 mL/kg組總糖較美國組、臺灣組分別高出14.01%、6.81%。

2.4 不同乳酸菌添加劑對甜高粱青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

通過測定青貯后各組有機酸的含量及氨基酸態(tài)氮/總氮的比例，以分析不同乳酸菌添加劑對甜高粱青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響，結(jié)果如表8所示。

表8 乳酸菌添加劑對甜高粱青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響Table8 Effect of lactic acid bacteria additive on fermentation quality of sweet sorghum silage

由表8可知，從氨基酸態(tài)氮/總氮比值來看，添加菌劑組氨態(tài)氮/總氮比值均低于對照組。氨基酸態(tài)氮與總氮的比值是反應(yīng)青貯飼料中蛋白質(zhì)分解程度，比值越大，說明青貯飼料中蛋白質(zhì)分解越多，青貯品質(zhì)越差[20]。實驗組中添加量為1.5 mL/kg的處理組氨基酸態(tài)氮/總氮比值最低，為7.43%，比對照組低了2.67%，表明蛋白質(zhì)降解最少，說明該處理組發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)于其他組；從有機酸的含量來看，乳酸、乙酸、丙酸的含量較對照均增加，各處理組均未檢測出丁酸的存在，丁酸由酪酸菌產(chǎn)生，可反應(yīng)青貯料的腐敗程度，丁酸越多，青貯飼料越腐敗。青貯質(zhì)量的優(yōu)劣取決于乳酸菌的作用，乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物是乳酸，因此乳酸的含量反映了青貯的質(zhì)量[21]。各處理組乳酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05），其中1.5 mL/kg組乳酸含量最高，為9.34 g/kg，比對照高了177.15%，比美國組、臺灣組分別高出29.9%、31.18%；1.0mL/kg組乳酸含量較對照高了175.07%；0.5mL/kg組較對照高了153.11%；自制混合型乳酸菌劑中存在的異型乳酸菌Lac4發(fā)酵除生成乳酸外，還通過果膠聚糖單磷酸鹽途徑生成乙酸和二氧化碳，乙酸有很強的抗真菌功能，乙酸含量的提高會提高青貯物的有氧穩(wěn)定性。從發(fā)酵后乙酸的含量來看，實驗組均高于對照組，除2.0 mL/kg組外，其他各組乙酸含量與對照相比均存在顯著性差異（P＜0.05），其中，0.5 mL/kg組乙酸含量最高，為8.58 g/kg，比對照高了5.67g/kg；1.5mL/kg組次之，較對照高了3.77 g/kg；美國組、臺灣組分別比對照高了2.29 g/kg、2.06 g/kg。丙酸可抑制真菌繁殖，防止二次發(fā)酵，提高青貯的有氧穩(wěn)定性。從丙酸含量來看，實驗組均顯著高于對照組（P＜0.05），其中，1.0 mL/kg組最高，為2.86g/kg；1.5 mL/kg組次之，為2.73 g/kg，分別比對照高了1.97 g/kg、1.84 g/kg；美國組和臺灣組分別較對照組高了1.41 g/kg、0.72 g/kg。

2.5 甜高粱青貯飼料質(zhì)量評價綜合得分

通過pH得分、氨基酸態(tài)氮/總氮得分、以及各有機酸所占比例的得分，綜合評價甜高梁青貯飼料質(zhì)量，結(jié)果如表9所示。

表9 甜高粱青貯飼料質(zhì)量評價綜合得分結(jié)果Table9 Comprehensive score results of quality evaluation of sweet sorghum silage

由表9的綜合評分可得，自制乳酸菌復(fù)合菌劑添加量為1.0 mL/kg、1.5 mL/kg、2.0 mL/kg時，青貯甜高梁質(zhì)量評價為優(yōu)等；0.5 mL/kg組、2.5 mL/kg組質(zhì)量綜合評價為良好自制組評分均高于商品菌劑臺灣組和美國組。說明自制乳酸菌復(fù)合菌劑可以提高甜高梁青貯品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究通過測定分析5組不同添加劑量的自制復(fù)合乳酸菌劑以及美國、臺灣商品青貯菌劑對甜高梁秸稈青貯后的感官評價，營養(yǎng)成分以及發(fā)酵品質(zhì)，綜合評價青貯品質(zhì)，以探討自制復(fù)合乳酸菌劑對甜高梁秸稈青貯的最佳添加量。研究發(fā)現(xiàn)，添加量為1.5 mL/kg時，其乳酸含量比對照高了177.15%，比美國組、臺灣組分別高出29.9%、31.18%；粗蛋白含量較對照高了25.61%，總糖含量較對照高18.18%，比美國組、臺灣組分別高出14.01%、6.81%，綜合來看，1.5 mL/kg實驗組甜高梁青貯品質(zhì)優(yōu)于美國、臺灣組，也優(yōu)于其他各劑量實驗組，這對確定自制復(fù)合乳酸菌青貯菌劑的最佳添加量意義重大，對實驗室自制青貯菌劑的推廣和應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。