藥食兩用植物提取液對(duì)李果實(shí)采后常見致腐真菌抑制作用

張 煒，吳正云*，羅 力，羅愛民，張文學(xué)

（1.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川 成都 610065；2.古藺力苑農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司，四川 瀘州 646500）

李果實(shí)成熟期一般在7、8月份，采后極易遭到微生物侵染而腐敗，造成經(jīng)濟(jì)損失。已有研究表明，引起李果實(shí)腐敗變質(zhì)的微生物包括褐腐病菌（Monilinia fructicola）、酵母菌（Saccharomycetes）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）等，其中褐腐病菌是最主要的致腐真菌[1-3]。目前主要使用人工合成的化學(xué)殺菌劑來控制李果實(shí)采后的微生物侵染（如撲海因、特克多、仲丁胺等），但這些化學(xué)合成物質(zhì)殘留量較大，長(zhǎng)期攝入過多后會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害[4-5]，因此尋找更加安全、有效的控制李果實(shí)采后病害的方法十分迫切。近年來很多研究證實(shí)了天然植物抑菌成分對(duì)果蔬貯藏保鮮的效果[6-9]，吳振宇等[10]研究了黃連等四種植物提取物對(duì)桃褐腐病的抑制作用，得出黃柏和黃連以1∶7復(fù)配增效作用最顯著。艾啟俊[11]研究發(fā)現(xiàn)，鹿蹄草提取液對(duì)根霉、黑曲霉、青霉有明顯抑制作用，在蘋果貯藏防腐方面有良好效果。本研究通過離體抑菌實(shí)驗(yàn)，從甘草、肉桂、丁香、高良姜、小茴香、八角、肉豆蔻七種植物原料中篩選出能有效抑制褐腐病菌（Monilinia fructicola）、酵母菌（Saccharomycetes）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）生長(zhǎng)的植物原料，將抑菌效果較好的甘草、肉桂提取液聯(lián)合使用，研究其對(duì)褐腐病菌的抑制效果，并通過生化檢測(cè)探究這兩種提取液對(duì)褐腐病菌的抑菌機(jī)理，為天然防腐劑的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

肉桂、丁香、高良姜、甘草、小茴香、八角、肉豆蔻：四川省成都市武侯區(qū)華安堂藥業(yè)零售連鎖有限公司；褐腐病菌（Monilinia fructicola）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）；黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、酵母菌（Saccharomycetes）：四川大學(xué)生態(tài)食品工程與生物技術(shù)研究室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；考馬斯亮藍(lán)G250、無水葡萄糖、瓊脂、酵母膏、蛋白胨：成都市科龍?jiān)噭┯邢薰尽?shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，無水葡萄糖2%，瓊脂1.5%～2.0%，自然pH，121℃滅菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母膏1%，無水葡萄糖2%，瓊脂1.5%～2.0%，自然pH，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

JSP-250高速多功能粉碎機(jī)：浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠；RE52-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海申順生物科技有限公司；SpectraMax-90酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；TDZ5-WS低速離心機(jī)：湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DDS-307電導(dǎo)率儀：上海越平科學(xué)儀器有限公司；UV-1600型紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

褐腐病菌、黑曲霉和米曲霉在無菌條件下，用PDA培養(yǎng)基斜面活化，置于28℃條件下培養(yǎng)2～3 d，用生理鹽水洗下，制成105CFU/mL的單孢子懸液，低溫保存?zhèn)溆谩＝湍妇跓o菌操作下從YEPD培養(yǎng)基斜面中取出，接種到裝有液體YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中，置于28℃條件下培養(yǎng)2 d，將培養(yǎng)液在4000r/min條件下離心10min，用生理鹽水洗滌2次，棄去上清液，加入生理鹽水制成105CFU/mL菌懸液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 植物提取液制備

將七種植物原料分別粉碎后過40目篩（孔徑0.37mm），分別稱取10.0 g，裝入有磨口塞的三角燒瓶中，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，浸泡48 h，超聲30 min后抽濾；收集濾液后重復(fù)上述過程再提取1次，合并濾液將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL，即得到七種植物提取液原液，置于常溫避光條件下，密封保存，備用。

1.3.3 植物提取液抑菌圈測(cè)定

采用濾紙片法[11]測(cè)定抑菌圈直徑（濾紙片直徑6 mm）。抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)[12]：抑菌圈直徑＞15 mm就表明該微生物對(duì)抑菌劑高度敏感、10～15 mm為中度敏感、6～10 mm為低度敏感、＜6 mm則為不敏感。

1.3.4 植物提取液最低抑菌濃度測(cè)定

采用倍比稀釋法[13]測(cè)定最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）。用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液OD600nm值。培養(yǎng)前后的OD600nm值未發(fā)生變化即表示供試微生物在此條件下沒有生長(zhǎng)，此時(shí)的濃度即為該植物提取液的MIC。一般認(rèn)為MIC≤62.5 mg/mL時(shí)抑菌效果較好，MIC≥125 mg/mL時(shí)抑菌效果較差[14]。

1.3.5 甘草、肉桂復(fù)配提取液抑菌效果評(píng)價(jià)

采用微量棋盤稀釋法[15]將甘草、肉桂提取液進(jìn)行復(fù)配，測(cè)定復(fù)配提取液的抑菌效果。甘草和肉桂復(fù)配提取液的抑菌效果可用分級(jí)抑制濃度（fractional inhibitory concen tration，F(xiàn)IC）指數(shù)加以評(píng)價(jià)。FIC指數(shù)=MIC復(fù)合A/MIC單一A+MIC復(fù)合B/MIC單一B。FIC指數(shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)：FIC指數(shù)≤0.5，協(xié)同作用；0.5＜FIC指數(shù)≤1.0，相加作用；1.0＜FIC 指數(shù)＜4.0，無相關(guān)作用；FIC指數(shù)≥4.0，拮抗作用。

1.3.6 甘草、肉桂提取液對(duì)褐腐病菌抑菌機(jī)理研究

甘草、肉桂提取液對(duì)褐腐病菌菌液電導(dǎo)率及對(duì)褐腐病菌菌液可溶性蛋白質(zhì)的影響分別參照文獻(xiàn)[16-17]的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液對(duì)四種致腐真菌的抑菌圈直徑

質(zhì)量濃度為1.0 g/mL和0.5 g/mL的植物提取液對(duì)四種致腐真菌抑菌圈直徑測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，質(zhì)量濃度為1.0 g/mL和0.5 g/mL的甘草提取液對(duì)褐腐病菌抑菌作用最強(qiáng)，其抑菌圈直徑為12.03 mm、11.33 mm，抑菌效果為中度敏感，而對(duì)其他三種真菌（酵母菌、米曲霉及黑曲霉）無抑菌效果。肉桂提取液對(duì)酵母菌、米曲霉、黑曲霉三種供試菌抑菌作用最強(qiáng)，質(zhì)量濃度為1.0 g/mL和0.5 g/mL的肉桂提取液對(duì)其抑菌圈直徑分別為21.25mm、10.19mm，13.28mm、10.79 mm，17.49 mm、15.62 mm，抑菌效果為中高度敏感。其他植物提取液對(duì)上述四種致腐真菌的抑菌效果相對(duì)較弱，其抑菌圈直徑維持在6～12 mm。

表1 七種藥食兩用植物提取液對(duì)四種致腐真菌的抑菌圈測(cè)定結(jié)果Table1 Determination results of the inhibition zone of seven kinds of medicinal and edible plants extracts on four kinds of rot-causing fungi

2.2 提取液對(duì)四種致腐真菌的MIC

植物提取液對(duì)四種致腐真菌的MIC測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可知，七種植物提取液對(duì)褐腐病菌、黑曲霉的MIC≤62.5mg/mL，抑菌效果好；肉桂、丁香、八角茴香提取液對(duì)酵母菌的MIC值分別為15.63mg/mL、31.25mg/mL、62.50mg/mL，抑制作用強(qiáng)；八角茴香提取液對(duì)米曲霉的MIC值為31.25mg/mL，抑菌效果好。

表2 七種藥食兩用植物提取液對(duì)四種致腐真菌的MIC測(cè)定結(jié)果Table2 Determination results of the MIC of seven kinds of medicinal and edible plants extracts on four kinds of rot-causing fungi

綜合來看，對(duì)褐腐病菌抑制作用最強(qiáng)的是甘草提取液，MIC值為7.81 mg/mL，1.0 mg/mL甘草提取液抑菌圈直徑為12.03 mm。對(duì)酵母菌、米曲霉、黑曲霉抑制作用最強(qiáng)的是肉桂提取液，MIC值分別為15.63 mg/mL、125.00 mg/mL、31.25 mg/mL，1.0 mg/mL肉桂提取液抑菌圈直徑分別為21.25 mm、13.28 mm、17.49 mm；但其對(duì)褐腐病菌的MIC值為15.63 mg/mL，抑菌圈直徑為8.83 mm，抑制效果弱于甘草提取液。

2.3 甘草、肉桂復(fù)配提取液對(duì)褐腐病菌的抑菌效果

甘草和肉桂復(fù)配提取液對(duì)褐腐病菌的聯(lián)合抑菌效果見表3。由表3可知，在1/2MIC甘草提取液與1/4MIC肉桂提取液聯(lián)合作用下，對(duì)褐腐病菌的抑制作用明顯。此時(shí)FIC指數(shù)為0.75，抑菌效果增強(qiáng)。

表3 甘草和肉桂復(fù)配提取液對(duì)褐腐病菌聯(lián)合抑菌效果Table3 Antibacterial effects of compound extracts of licorice and cinnamon onMonilinia fructicola

2.4 甘草和肉桂提取液對(duì)褐腐病菌抑制作用機(jī)理的探討

植物提取液主要通過破壞酵母菌、米曲霉、黑曲霉等真菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜滲透性從而發(fā)揮抑菌作用[18]，但其對(duì)褐腐病菌抑制作用機(jī)理的報(bào)道不多。選擇褐腐病菌為研究對(duì)象，進(jìn)一步研究甘草、肉桂提取液對(duì)其的抑制作用機(jī)理。甘草和肉桂提取液對(duì)褐腐病菌菌液相對(duì)電導(dǎo)率和可溶性蛋白質(zhì)含量影響結(jié)果見圖1。

圖1 甘草、肉桂提取液處理下褐腐病菌菌液相對(duì)電導(dǎo)率（A）和可溶性蛋白質(zhì)含量（B）的變化Fig.1 Changes of relative conductivity(A)and soluble protein content(B)ofMonilinia fructicolasolution treated with licorice and cinnamon extracts

從圖1A可知，甘草、肉桂提取液處理0～30 min，菌液相對(duì)電導(dǎo)率迅速升高，并在30 min時(shí)達(dá)到峰值，分別為96.64%、48.47%，此后基本保持不變。在整個(gè)時(shí)間段，對(duì)照組相對(duì)電導(dǎo)率變化幅度很小，保持在6%左右。由圖1B可知，可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì)與電導(dǎo)率變化趨勢(shì)一致，在整個(gè)時(shí)間段，對(duì)照組可溶性蛋白質(zhì)含量維持在6.0 μg/mL左右，而甘草、肉桂處理組可溶性蛋白質(zhì)含量在30min時(shí)達(dá)到最大值，分別為50.6μg/mL、25.1μg/mL，此后基本保持不變。細(xì)胞正常代謝必須依靠一個(gè)完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，其滲透性發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)部電解質(zhì)大量外泄至細(xì)胞外，導(dǎo)致培養(yǎng)液電導(dǎo)率上升，鑲嵌在細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)泄露到細(xì)胞外，使培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量增加[19]。由圖1推測(cè)甘草、肉桂提取液處理破壞了菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外滲，可溶性蛋白質(zhì)含量上升。已有研究[20-21]顯示，甘草、肉桂提取液發(fā)揮抑菌作用主要是通過改變細(xì)胞膜滲透性及破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)得以實(shí)現(xiàn)，與本研究得出的結(jié)論相似。在本研究中，甘草對(duì)褐腐病菌抑制效果明顯強(qiáng)于肉桂，推測(cè)是由于兩種植物提取液在細(xì)胞膜上抑菌作用位點(diǎn)不同，從而導(dǎo)致抑菌效果出現(xiàn)差異。

3 結(jié)論

本研究以褐腐病菌、酵母菌、黑曲霉、米曲霉為供試菌，通過體外抑菌試驗(yàn)研究了甘草、肉桂、丁香等七種植物提取液的抑菌效果。結(jié)果表明，1.0 g/mL甘草提取液對(duì)褐腐病菌有較強(qiáng)的抑制效果，抑菌圈為12.03 mm；1.0 g/mL肉桂提取液對(duì)酵母菌、黑曲霉、米曲霉有較強(qiáng)的抑制效果，抑菌圈直徑分別達(dá)到21.25 mm、17.49 mm、13.28 mm。1/2MIC甘草提取液與1/4MIC肉桂提取液聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)褐腐病菌的FIC指數(shù)為0.75，表現(xiàn)為相加作用。甘草、肉桂提取液處理后腐病菌培養(yǎng)液相對(duì)電導(dǎo)率分別為96.64%、48.47%，可溶性蛋白質(zhì)含量增加至50.6 μg/mL、25.1 μg/mL，提示其抑菌機(jī)制可能是通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致褐腐病菌死亡。