首烏藤總黃酮提取工藝優化及抗氧化性研究

王振吉，楊申明*，張光勇

（楚雄師范學院 化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000）

首烏藤（Polygoni multiforiCaulis）又名夜交藤，為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥藤莖或帶葉藤莖[1]。它是一種藥食兩用植物，具有養血安神、祛風通絡之功效，臨床上主要用于治療失眠多夢、血虛身痛、肌膚麻木、風疹瘙癢等病癥[2]。已有研究表明，首烏藤中的蒽醌類、黃酮類具有改善睡眠功效[3-5]。黃酮類化合物對人體無毒無害，具有抗氧化、清除自由基、抗癌、抗病毒等作用，在食品添加劑、醫藥、化妝品等領域得到廣泛的應用[6-8]。因此，研究首烏藤總黃酮的提取及生物活性，對提高首烏藤資源的綜合利用具有十分重要的意義。

目前，對首烏藤總黃酮的提取已有相關研究報道。潘佳偉等[9]用表面活性劑輔助提取首烏藤總黃酮，其得率為6.0%；肖揚等[10]用乙醇為溶劑提取首烏藤總黃酮，其提取率為21.35%；史俊燕[11]用乙醇為溶劑提取總黃酮，其提取率為3.19%。目前，對首烏藤總黃酮的提取主要采用有機溶劑，容易對環境造成污染，而針對首烏藤總黃酮的水提工藝及抗氧化性研究鮮見報道。

本研究以首烏藤為試驗材料，實驗室自制超純水為提取溶劑，在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優化超聲波輔助提取首烏藤總黃酮的工藝條件；同時，以維生素C（vitamin C，VC）為陽性對照，對首烏藤總黃酮從清除1,1-苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH的能力來評價其抗氧化性，以期為首烏藤黃酮類物質的深入研究及其在功能性食品等方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

首烏藤（Polygoni multifori）：采自雙柏縣妥甸，經鑒定為蓼科植物何首烏干燥藤莖；蘆丁標準品（純度≥98%）：中國藥品生物制品檢定所；DPPH、維生素C：昆山諾普森實驗室用品科技有限公司；超純水：實驗室自制；其他所用化學試劑均為分析純：天津化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

Alpha-1502型紫外可見分光光度計：上海譜元儀器有限公司；UPT-1-100L型優普系列超純水器：四川優普超純科技有限公司；KQ520OB型超聲波清洗器：上?？茖С晝x器有限公司；2代運邦多功能粉碎機：永康市速鋒工貿有限公司；SE40ZF電子天平：奧豪斯儀器有限公司；HH-S2S型恒溫水浴鍋：金壇市大地自動化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮提取工藝流程

1.3.2 總黃酮含量測定

（1）蘆丁標準曲線繪制

以蘆丁為標準品，采用A（lNO）33-NaNO2比色法測定總黃酮含量[12]。以蘆丁標準溶液含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，得蘆丁標準曲線線性回歸方程：y=10.382x-0.000 3，相關系數R2=0.999 36。

（2）首烏藤總黃酮含量的計算

式中：C為供試品溶液中總黃酮質量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；N為稀釋倍數，M為首烏藤干粉的質量，g。

1.3.3 總黃酮提取工藝優化單因素試驗

分別考察以下單因素的影響：（1）超聲功率分別為150W、200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W的條件下進行提取，料液比1∶50（g∶mL）、超聲時間80 min、超聲溫度60 ℃；（2）確定超聲功率300 W，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90 ℃的條件下進行提取，料液比1∶50（g∶mL）、超聲時間80 min；（3）確定超聲溫度60℃，分別在超聲時間20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min的條件下進行提取，超聲功率300 W、料液比1∶50（g∶mL）；（4）確定超聲時間100min，分別在料液比1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60（g∶mL）的條件下進行提取，超聲功率300 W、超聲溫度60℃。

1.3.4 總黃酮提取工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以首烏藤總黃酮含量為評價指標，以超聲功率（A）、超聲溫度（B）、超聲時間（C）、料液比（D）為試驗考察因素，設計L（934）正交試驗探索最優總黃酮提取工藝條件，因素及水平見表1。

表1 總黃酮提取工藝優化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal tests for total flavonoids extraction technology optimization

1.3.5 首烏藤總黃酮抗氧化活性測定

將首烏藤總黃酮配制成0.0034mg/mL、0.0068mg/mL、0.013 6 mg/mL、0.027 2 mg/mL、0.054 4 mg/mL 5 種質量濃度，分別測定其對DPPH·、·OH的清除率，同時，以維生素C為對照，評價其抗氧化性。

（1）DPPH·清除率測定

參照文獻[13-15]的測定方法。

（2）·OH清除率測定

參照文獻[16-17]的測定方法。

2 結果與分析

2.1 總黃酮提取工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 超聲波功率對首烏藤總黃酮提取效果的影響

圖1 超聲波功率對總黃酮提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the extraction of total flavonoids

由圖1可知，隨著超聲功率在150～450W范圍內的增大，首烏藤總黃酮含量先增大后減??；當超聲波功率為300 W時，總黃酮含量達最大1.23mg/g；當超聲功率＞300W之后，總黃酮含量有所下降。出現這種現象的原因可能是提高超聲波功率，能增加首烏藤細胞的破碎程度，使首烏藤總黃酮的溶出率升高。但是極端的增大超聲波功率會增加能耗，同時由于超聲波的強化和機械作用，可能會破壞生物活性物質的分子鏈，造成已經溶出的活性物質分子的不正常降解[18-19]，降低生物活性。因此，確定適宜的超聲波功率為300 W。

2.1.2 超聲溫度對首烏藤總黃酮提取效果的影響

圖2 超聲提取溫度對總黃酮提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction temperature on the extraction of total flavonoids

由圖2可知，隨著超聲溫度在40～90℃范圍內的升高，首烏藤總黃酮含量先增大后減小；在超聲溫度為60℃時，總黃酮含量達最大1.24 mg/g；在超聲溫度高于60℃之后，總黃酮含量有所下降。出現這種現象的原因可能是隨著超聲溫度的升高，分子運動速度加快，含量增大，但溫度過高，會破壞部分黃酮類化合物結構并增加其他非黃酮類物質溶出[20]，影響黃酮類物質的生物活性和總黃酮含量。因此，確定適宜的超聲溫度為60℃。

2.1.3 超聲時間對首烏藤總黃酮提取效果的影響

圖3 超聲提取時間對總黃酮提取效果的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction of total flavonoids

由圖3可知，超聲時間＜100 min之前，總黃酮含量隨超聲作用時間的延長而呈增大趨勢；當超聲時間為100 min時，總黃酮含量達最大值1.25 mg/g；之后隨超聲時間的延長而總黃酮含量略有下降趨勢。這可能是在一定時間范圍內，超聲波有利于首烏藤中水分的滲入和細胞壁的破碎，增加了首烏藤中黃酮類物質的溶出，但隨著提取時間的增加，會使黃酮類物質分子結構破壞[21]，從而影響總黃酮含量。因此，確定適宜的超聲時間為100 min。

2.1.4 料液比對首烏藤總黃酮提取效果的影響

圖4 料液比對總黃酮提取效果的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the extraction of total flavonoids

由圖4可知，首烏藤總黃酮隨著提取溶劑用量的增大，總黃酮含量有增大的趨勢，當料液比達1∶45（g∶mL）時，總黃酮含量達最大1.24 mg/g。之后若繼續增加溶劑用量，總黃酮含量基本不再增大，反而略有緩慢下降趨勢。這可能是因為料液比達到1∶45（g∶mL）時，黃酮類物質已基本溶出，繼續增加溶劑用量反而有利于首烏藤中其他雜質的溶出，使得總黃酮含量下降。因此，確定適宜的料液比為1∶45（g∶mL）。

2.2 總黃酮提取工藝優化正交試驗結果

表2 提取工藝優化正交試驗結果與分析Table2 Results and analysis of orthogonal tests results for extraction technology optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table3 Variance analysis of orthogonal experimental results

由表2可知，影響主次順序依次為B＞C＞A＞D，即超聲溫度＞超聲時間＞超聲功率＞料液比。首烏藤總黃酮最佳提取工藝組合為A3B2C3D3，即超聲功率350 W，超聲溫度60 ℃，超聲時間120 min，料液比1∶50（g∶mL）。由于最佳組合不在9組試驗內，因此，在該條件下進行驗證性試驗，重復5次，測得首烏藤總黃酮平均含量為1.32 mg/g，大于正交試驗結果中的最大含量1.25mg/g，表明該方法重復性良好，適合于首烏藤總黃酮的提取。由表3可知，4個因素對首烏藤總黃酮含量均有顯著影響（P＜0.05）。

2.3 首烏藤總黃酮抗氧化性分析

2.3.1 清除DPPH·的能力評價

由圖5可知，首烏藤總黃酮在質量濃度0.003 4～0.0544mg/mL范圍內，隨著首烏藤總黃酮質量濃度的增加，清除DPPH·的能力增強。當總黃酮質量濃度為0.0544mg/mL時，對DPPH·的清除率可達到74.36%，高于陽性對照維生素C對DPPH·的清除率65.22%，說明首烏藤總黃酮具有較強的清除DPPH·的能力。

圖5 不同質量濃度首烏藤總黃酮對DPPH·的清除效果Fig.5 Scavenging ability of different concentration of total flavonoids fromPolygoni multiforion DPPH·

2.3.2 清除·OH的能力評價

從圖6分析可知，首烏藤總黃酮在質量濃度0.003 4～0.0544mg/mL范圍內，隨著首烏藤總黃酮質量濃度的增加，清除·OH的能力也增強。當總黃酮質量濃度為0.0544mg/mL時，首烏藤總黃酮對·OH的清除率可達到62.29%，低于陽性對照維生素C對·OH的清除率80.42%，但首烏藤總黃酮仍然表現出較強的清除·OH的能力。

圖6 不同質量濃度首烏藤總黃酮對·OH的清除效果Fig.6 Scavenging ability of different concentration of total flavonoids fromPolygoni multiforion·OH

3 結論

通過單因素試驗及正交試驗，優化得到的首烏藤總黃酮最佳超聲提取工藝為超聲功率350W，超聲溫度60℃，超聲時間120min，料液比1∶50（g∶mL）。在此最優條件下進行驗證性試驗，重復5次，得首烏藤總黃酮平均含量為1.32mg/g。

抗氧化性試驗結果表明，在首烏藤總黃酮的質量濃度0.003 4～0.054 4 mg/mL范圍內，隨著首烏藤總黃酮質量濃度的增加其清除DPPH·和·OH的能力逐步增強。表現出較強的清除DPPH·和·OH的能力，說明首烏藤總黃酮具有較強的抗氧化活性。