轉錄因子Snail對胃癌MKN-28細胞的增殖、凋亡及侵襲的影響

武平

（山西醫科大學晉祠學院，山西太原 030025）

胃癌屬于惡性腫瘤的一種，其發生率較高，并具有較高的致死率，嚴重威脅患者的健康及安全[1]。研究顯示，晚期胃癌患者死亡的一項重要原因即腫瘤細胞侵襲與轉移。因此，了解胃癌的發生情況，同時分析其侵襲、轉移機制，可為該病患者的治療提供有效參考[2-3]。Snail是一種鋅指蛋白轉錄因子，該因子在多種腫瘤疾病中均可發揮一定作用[4]。本研究就轉錄因子Snail對胃癌MKN-28細胞的增殖、凋亡及侵襲的影響進行了分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

自上海細胞庫選購胃癌MNK-28細胞株，選取基爾頓公司合成的慢病毒構建針對Snail設計的shRNA載體；同時選取CCK-8試劑盒（生產廠家：凱基公司）、Transwell小室（生產廠家：康寧公司），順鉑及其他試劑、培養基均由博爾美公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

于37 ℃、5%二氧化碳水平下，以PRMI 1640培養基（含10%胎牛血清）對MNK-28細胞進行培養；嚴密觀察細胞情況、定時換液，細胞密度達到80%時以胰酶消化處理，繼續培養。

1.2.2 篩選藥物濃度

取對數生長期的胃癌MNK-28細胞株，將選取的細胞株加至96孔板中，每孔加入100 μL懸濁液，密度設置為1×104個/mL，連續培養24 h；分別在孔中加入2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的順鉑，培養時間分別為12 h、24 h、48 h；同時每孔中加入10 μL CCK-8；然后于37 ℃、5%二氧化碳的培養箱中繼續培育2 h，之后利用酶標儀進行450 nm波長的吸光度值（OD值）測定；每組細胞均分別設置3個復孔。

1.2.3 細胞增殖情況觀察

細胞增殖情況以CCK-8法觀察，在96孔板中加入對數生長期的MKN-28細胞，每孔中加入細胞懸液100 μL，確保每孔細胞密度為1×104個/mL；并設置復孔，繼續培養24 h，之后加入順鉑、shRNA+Snail、shRNA+Snail+順鉑等處理因素，繼續進行培養；每孔加入10 μL CCK-8，于培養箱中培養2 h，以空白對照標零，利用酶標儀進行吸光度值測定。

1.2.4 細胞凋亡情況觀察

以電鏡觀察細胞凋亡情況，在96孔板中加入密度為4×105個/mL的MKN-28細胞，并加入相關刺激因素，培養48 h，以胰酶消化細胞，離心10 min，棄上清液，以Palade緩沖液進行2次洗滌，洗滌后在1%鋨酸中懸浮細胞，固定于4 ℃環境下1 h，再以相同緩沖液進行洗滌2次。之后進行脫水處理，脫水后在丙酮/包埋劑置換30 min，置換后在包埋劑中浸潤2 h，之后進行包埋、切片、染色等處理，最后于電子顯微鏡下對細胞情況進行觀察。

1.2.5 細胞侵襲情況觀察

對細胞侵襲情況進行分析，觀察方式選用Transwell小室，收集經相關因素刺激后的對數生長期細胞，調整細胞密度至2×105個/mL，在Transwell小室上部接種，在37 ℃環境下培養24 h；之后將Transwell膜取出，反復洗滌，并用4%多聚甲醛固定15 min，用0.1%結晶染色10 min；最后于顯微鏡下進行拍照觀察，統計穿過Transwell膜的細胞數量。

1.3 統計學分析

以SPSS20.0統計學軟件對數據資料進行處理，計量資料“±”以t檢驗，計數資料（%）以χ2檢驗，p＜0.05為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 藥物濃度篩選結果分析

以酶標儀進行OD值測量，以OD值表示細胞存活率，MKN-28細胞在經不同濃度的順鉑培養48 h后，其細胞存活率均明顯降低，且隨著順鉑濃度的增加，其細胞存活率逐漸下降。經分析，于5 μg/mL、作用48 h時殺傷效率最理想，見表1。

表1 藥物濃度篩選結果

2.2 沉默Snail基因對MNK-28細胞增殖情況的影響

經CCK-8法對各組MNK-28細胞增殖能力進行觀察，以OD值表示細胞增殖能力，作用48 h后進行比較，順鉑處理及慢病毒沉默Snail基因均可見細胞增殖抑制現象，而shRNA+Snail+順鉑組細胞增殖抑制率顯著高于其他組（p＜0.05），見表2。

表2 沉默Snail基因對MNK-28細胞增殖情況的影響

2.3 沉默Snail基因對MNK-28細胞凋亡的影響

于電鏡下對細胞凋亡情況觀察分析，可以觀察到內皮網明顯稀疏，細胞質明顯濃縮，內質網稀疏，并和細胞膜融合形成空泡，細胞核也明顯縮小，同時線粒體體積變大，并可見已凋亡細胞發生裂解，構成凋亡小體。shRNA+Snail+順鉑組凋亡小體相較于其他組別，表現地更為明顯，見圖1。

圖1 細胞凋亡情況觀察

2.4 沉默Snail基因對MNK-28細胞侵襲情況的影響

以Transwell小室觀察細胞侵襲情況，以穿過Transwell膜的細胞數量進行表示，以OD值進行計數，shRNA+Snail+順鉑組細胞遷出的細胞數較其他組明顯降低（p＜0.05），見表3。

表3 沉默Snail基因對MNK-28細胞侵襲情況的影響

3 討論

胃癌屬于惡性腫瘤性疾病的一種，起源于胃黏膜上皮，其發生率較高，占據了我國各種腫瘤的首位[5]。該病患者多為50歲以上的中老年人群，且男性的發生率約為女性的2倍[6]。近年來，隨著人們生活習慣、飲食結構的改變及工作壓力的增大，該病的發生率呈明顯增長趨勢。該病發生早期通常無明顯癥狀，極易被患者忽略，多數患者就診時已處于晚期狀態。手術是目前臨床上治療胃癌的常用方式，但術后患者復發及轉移率較高，通常可達到40%～60%。而胃癌轉移屬于胃癌的重要特征，是導致患者死亡的重要因素[7]。故而加強對胃癌侵襲、轉移的研究非常重要。

Snail屬于鋅指蛋白轉錄因子的一種，定位于人類染色體20q12.3。有研究表明，Snail在小鼠結腸癌腫瘤細胞凋亡及增殖中發揮著重要作用。同時有研究顯示[8]，Snail能夠調節細胞周期蛋白CyclinD2，且其異常表達還可能會影響p53及一些促凋亡因子表達情況，進而可對腫瘤生長造成影響。

本次研究分析了Snail對胃癌MKN-28細胞增殖、凋亡及侵襲的影響，結果顯示順鉑處理及慢病毒沉默Snail基因均可見細胞增殖抑制現象，而shRNA+Snail+順鉑組其細胞增殖抑制率顯著高于其他組（p＜0.05）；與單純MKN-28細胞組比較，不同刺激因素組細胞凋亡程度均顯著升高（p＜0.05）；這說明，Snail可對胃癌MKN-28細胞的增殖與凋亡造成影響。

胃癌細胞轉移與浸潤屬于復雜過程，常會涉及較多方面，如細胞自原發病灶中脫落，并將基底膜浸潤、穿透，細胞之間黏附力不同，可對浸潤造成影響[9]等。從實質上說，癌細胞的浸潤和轉移是黏附和去黏附的交替過程，其和E-cadherin的表達之間密切相關。上皮間質轉換則在胚胎時期器官發育過程中承擔著重要職責，和腫瘤局部浸潤、侵襲能力均有較大關聯，而E-cadherin為上皮細胞的關鍵分子，其表達水平下降則為其典型表現，Snail基因則可對其表達情況進行調節[10]。本次研究結果顯示，經Snail基因調節后，各組細胞侵襲能力均有所下降，且shRNA+Snail+順鉑組細胞遷出的細胞數較其他組明顯降低（p＜0.05）；提示Snail可在一定程度上對細胞侵襲能力造成影響，而Snail可能會在一定程度上提高順鉑的活性。

綜上所述，轉錄因子Snail可對胃癌MKN-28細胞的增殖情況產生影響，沉默Snail基因有利于加速細胞凋亡，提高化療藥敏感性，有較好的臨床應用前景。