深Ⅱ度燙傷后小型豬皮膚愈合的組織病理學研究*

邱 波 王 艷 鄭曉霞 張海靜 張 鑫 王鳳乾 胡建廷

(1. 山東省藥學科學院，山東省化學藥物重點實驗室，濟南 2501010) (2. 山東英才學院，濟南 250104)

燙傷是外科常見的創傷性疾病，大多數燙傷多為Ⅱ度以下的中、小面積燙傷[1]。為了更好地研究人類皮膚燙傷這一外科常見疾病，選擇符合臨床發病過程和創面主要因素的動物模型至關重要[2-4]。研究燙傷動物模型應選用與人體結構、功能、代謝及特征相似的動物。小型豬皮膚組織結構與人類很相似[5]，包括體表毛發的疏密、表皮厚薄、皮下脂肪層、表皮形態學和增生動力學(豬30 d，人21 d)，以及皮膚燒傷后的體液和代謝變化等均非常相似，是進行各種皮膚創傷動物模型制備的理想選擇。文獻報道的燙傷模型制備方法有電熱燙傷和恒溫恒壓電燙傷，這些方法在運用當中各有其優缺點[6-8]。本研究參考上述燙傷方法的條件，使用恒溫燙傷儀，將恒溫燙傷儀探頭于110 ℃下，持續接觸20 s，壓力約1 000 g，于巴馬小型豬背部脊柱側制備深Ⅱ度燙傷創面，每個燙傷創面面積約為20 cm2。分別在第1、3、7、14、21、28天觀察皮膚創傷愈合情況，根據皮膚組織愈合的規律及實驗的可操作性，選擇在第1、

14、28天取樣，利用HE、Masson染色及免疫組化CD31染色的方法觀察皮膚在不同時間點修復的動態病理學變化。

1 材料與方法

1.1 動物來源與飼養環境

巴馬小型豬普通級，12只，雌雄各半，4～6月齡，平均體質量14.6 kg，體長約65 cm，體高32 cm左右，胸圍55 cm；由北京實創世紀小型豬養殖基地提供，生產許可證號：SCXK(京)2013 0008，實驗動物質量合格證號：111014000000241，試驗前適應性飼養1周以上。

飼養條件：巴馬小型豬置不銹鋼籠中于普通級環境飼養，每籠1只。室溫19～26 ℃，濕度40%～70%，日溫差≤4 ℃，換氣次數8～10次/h，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。實驗動物使用許可證號：SYXK(魯)2014 0008。

1.2 試劑及儀器

蘇木素-伊紅(HE) 染色液由珠海貝索生物技術有限公司提供。 SP-0023 HistostainTM-Plus Kits免疫組化試劑盒，規格：18 mL，批號：AG08164417，由北京博奧森生物技術有限公司提供。HT15-1KT Masson染色試劑盒，規格：50 mL，批號：20170710，由美國SIGMA-ALDRICH公司生產。

YLS-5Q臺式超級溫控燙傷儀，由濟南益延科技發展有限公司生產。

1.3 方法

分別在燙傷后第1、3、7、14、21、28天觀察皮膚創傷愈合的肉眼形態學變化并進行創面愈合率的測定。創面愈合率的測定方法為在巴馬小型豬燙傷后第1、3、7、14、21、28天，分別對創面進行拍照，用ImageJ圖像分析系統測算創面愈合殘留面積(newarea at interval time，AI)與愈合面積百分率(healing rate，HR)，HR=(AO-AI)/AO×100%，AO(original incisional area)為燙傷后第1天創面面積[9]。選擇在第1、14、28天的皮膚創面上分別切取約1.5 cm×1.0 cm×1.0 cm的皮膚組織，經10%甲醛液固定進行常規脫水、包埋、石蠟切片、HE染色，并根據說明書步驟分別進行免疫組化CD31染色和Masson 染色[10]。

1.4 統計方法

采用 SPSS16.0軟件對數據進行統計分析。定量指標采用均數±標準差描述。用單因素方差分析(ANOVA)進行統計學檢驗；差異有統計學意義時(P≤0.05)，所有檢驗均為雙側檢驗 α=0.05。

2 結果

2.1 創面大體觀察

燙傷制備后，創面呈現與燙傷探頭形狀相同的圓形，創面發白，無光澤，偶見輕微出血，燙傷創面與周圍組織界限明顯，略低于周圍正常皮膚，質地較軟，無滲出及分泌物。燙傷后第1天至7天，燙傷表面逐漸由白色轉變為暗紅色，無異味及分泌物，質地逐漸變硬，多數創面形成焦痂，觸之皮革感。第7天至第14天，燙傷創面全部形成灰色焦痂，創面面積有收縮趨勢，有少量創面焦痂部分脫落，脫落后的皮膚呈粉紅色，觸之柔軟。燙傷第14天至28天，燙傷傷口逐漸脫痂，完成再上皮化，脫痂后皮膚多數呈暗紅色，少數與正常皮膚顏色相同。創面處有毛發生長。圖1 A-F分別為燙傷后第1、3、7、14、21、28天后的肉眼形態學觀察。

圖1 小型豬背部皮膚燙傷后不同時期的肉眼形態學觀察Fig. 1 The gross morphology of skin wound healing of Minipig after deep second degree burn at different times

2.2 創面愈合率

對不同時間點的創面進行拍照，用ImageJ圖像分析系統測算創面愈合殘留面積(newarea at interval time，AI)與愈合面積百分率(healing rate，HR)，巴馬小型豬背部皮膚燙傷后不同時期的愈合率見表1。由表1可見，雄性豬與雌性豬相比，雄性豬燙傷創面的愈合速率較快。

2.3 組織病理學

燙傷皮膚分別經HE、Masson、CD31染色方法進行組織病理學檢查，圖2A-C顯示損傷已經累積到真皮深層，達到深Ⅱ度燙傷的標準。圖2D-L顯示燙傷后皮膚組織分別在第14天和第28天修復的組織病理學變化。具體組織病理學變化見圖2。

表1 巴馬小型豬背部皮膚燙傷后不同時期的愈合率Table 1 Healing rate at different periods after burn on the skin of Ba-Ma Minipig’s back

圖2 巴馬小型豬深Ⅱ度皮膚燙傷后的病理組織學觀察注：A：燙傷第1天：創面表皮全層變性壞死脫落(三角形所示)，真皮深層呈凝固性壞死.(HE，×40);B：真皮層內膠原纖維腫脹變性呈均質 紅染條索狀(箭頭所示).(Masson染色，×100);C：真皮深層顯示未見標記的血管內皮細胞(三角形所示).(CD31染色，×100);D：圖C 高倍鏡下觀察(三角形所示).(HE，×200);E：燙傷第14天：創面由新生表皮覆蓋，表皮局灶性上皮島增生(箭頭所示)，還可見表皮上方 的結痂(三角形所示).(HE，×40);F：真皮深層內有少量淡染的膠原纖維(箭頭所示).(Masson染色，×100);G：燙傷第14天：創面有少 量血管(箭頭所示).(CD31染色，×100);H：圖G的高倍鏡下觀察(箭頭所示).(HE，×200); I：燙傷第28天：創面完全由新生表皮覆蓋 (三角形所示)，真皮深層內含有較多的肉芽組織.(HE，×40); J：真皮深層內有多量淡染的膠原纖維(三角形所示).(Masson染色，×100); K：燙傷第28天，創面有大量血管(箭頭所示).(CD31染色，×100); L：圖K的高倍鏡下觀察(箭頭所示).(HE，×200)Fig. 2 Histopathological observation on skin wound healing of minipig after deep second degree burnNote： A:On the first after burn,The epidermis show degeneration, necrosis and exfoliation (triangle), dermal manifeste as coagulative necrosis.(HE,×40); B:Collagen fibers in the layer of the dermis show swelling and degeneration, stained homogene ous red dyed cords(arrow). (Masson,×100); C:CD31 staining showed there is no blood vessel(triangle)(CD31 staining，×100); D:Higher magnification of FigureC (triangle). (HE,×200); E:On the 14th post burn, the wound covered with the newly grown epithelium, epithelial islands hyperplasia (arrow)and scab(triangle). (HE,×40); F:A small amount of lightly stained collagen fibers in the deep dermis (arrow). (Masson,×100); G: On the 14th, a little of blood vessel can be seen in the wound.(CD31,×100); H:Higher magnification of FigureG (arrow). (HE,×200); I:On the 28th, The wound is completely covered by the new epidermis(triangle), the more granulation tissue is present in the deeper layer of the dermis. (HE,×40); J:Lightly stained collagen fibers in the deep dermis (triangle).(Masson,×100); K: On the 28th, a great many blood vessel can be seen in the wound. (CD31,×100); L:Higher magnification of FigureK(arrow). (HE,×200)

3 討論

皮膚創傷愈合包括各種組織的再生和肉芽組織增生、瘢痕組織形成的復雜組合，表現出各種過程的協同作用。而不同層次和深度的皮膚燙傷引起的組織細胞變性壞死，會決定創面的修復方式，并直接影響皮膚的預后[11]。對于人的皮膚來說：如Ⅰ度燙傷因為基底細胞健在，無需特殊治療，不影響預后，無疤痕；淺Ⅱ度燒傷累積表皮全層和部分真皮淺層乳頭層，真皮層中的毛囊、汗腺和皮脂腺等附屬器健在，2 周內可以自愈；而深Ⅱ度燒傷累積到真皮深層，真皮層中還有部分的毛囊、汗腺和皮脂腺等附屬器健在，需要3～5周才能康復。

本試驗通過對燙傷創面的組織學檢查，證實損傷已經累積到真皮深層，建立了豬深Ⅱ度燙傷模型。隨后觀察深Ⅱ度燙傷的皮膚在不同時間點修復的病理學變化。肉眼形態學觀察，燙傷后第1天至7天，燙傷表面逐漸由白色轉變為暗紅色，無異味及分泌物，質地逐漸變硬，多數創面形成焦痂，觸之皮革感。第7天至第14天，燙傷創面全部形成灰色焦痂，創面面積有收縮趨勢，有少量創面焦痂部分脫落，脫落后的皮膚呈粉紅色，觸之柔軟。燙傷第14天至28天，燙傷傷口逐漸脫痂，完成再上皮化，脫痂后皮膚多數呈暗紅色，少數與正常皮膚顏色相同。創面處有毛發生長。愈合率結果顯示，雄性豬燙傷創面的愈合速率較快。組織病理學變化顯示，燙傷后第1天，燙傷早期時創面表皮全層變性壞死脫落，真皮深層組織呈凝固性壞死，壞死組織內的膠原纖維經Masson染色染為橘紅色，也未見標記的血管內皮細胞。燙傷后第14天，以肉芽組織增生為主。創面基本由新生表皮覆蓋，表皮中局灶性上皮島增生，皮膚附件修復良好。真皮深層中可見新生的肉芽組織及少量的膠原纖維生成，肉芽組織內血管數量相對較少。燙傷第28天，皮膚已經基本愈合。除表皮各層相對成熟外，真皮層內還含有肉芽組織及膠原纖維，肉芽組織內的血管數量及膠原纖維的含量均較燙傷后第14天增多，但該時期內皮膚組織還未完全成熟，此期內肉芽組織還是在向瘢痕組織進行轉變，這一轉變過程可能還需要一段時間來完成皮膚組織的完全修復。