RT-qPCR檢測Wistar大鼠黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因 轉錄水平方法的建立*

王陳蕓 李哲麗 葉尤松 蔡發晶 肖 涵 謝季平 唐東紅

(1.中國醫學科學院/北京協和醫學院 醫學生物學研究所,昆明 650118)(2. 云南省中醫學院,昆明 650200) (3.昆明市科學技術情報研究所，昆明 650600)

黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(xanthine dehydrogenase/oxidase，XDH/XO)是一種嘌呤代謝的氧化過程中的限速酶，在嘌呤代謝過程中催化嘌呤代謝的最后兩步，即催化次黃嘌呤和黃嘌呤形成尿酸。XDH/XO基因的分布具有物種和組織特異性，在人體中主要存在于肝臟、小腸和血腦血管中，其基因定位于2號染色體斷臂上。靈長類體內尿酸氧化酶失活，尿酸成為嘌呤代謝的終產物[1-3]。當體內XDH/XO基因活性異常增高時，則會生成大量尿酸造成尿酸的沉積，導致血清尿酸濃度升高。女性血尿酸濃度>6.0 mg/dL，男性血尿酸濃度>7.0 mg/dL，即可診斷為高尿酸血癥[4]。高尿酸血癥不僅是痛風的發病基礎，還可造成多種心血管疾病和代謝相關疾病，且其發病率逐年上升，因此備受關注。研究高尿酸血癥就要研究其發病機理，所以對XDH/XO基因的研究極其重要，目前多有其組織分布，活性等的研究[5-6]。

實時熒光定量 PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time, RT-qPCR)技術于1996 年由美國 Applied Biosystems 公司推出，RT-qPCR實現了 PCR 從定性到定量的飛躍，而且與普通 PCR 相比，它具有特異性更強、重復性好、靈敏度高、定量準確、全封閉反應、自動化程度高等優點成為分子生物學研究中的重要工具，目前已得到廣泛應用[7]。Wistar大鼠是實驗大鼠(Rattusnorregicu,rat)的一個常用品系，其繁殖力強、生長發育快、性情溫順、對傳染病的抵抗力較強，是生物醫學方面研究的常用實驗動物，是目前高尿酸血癥動物模型研究中最為常用的實驗動物。為研究高尿酸血癥模型Wistar大鼠肝臟中XDH/XO基因轉錄水平的變化，本文采集Wistar大鼠肝臟總RNA，逆轉錄為DNA，設計引物進行RT-qPCR擴增，建立標準曲線，以在轉錄水平上對XDH/XO基因進行定量檢測。本方法的建立可用于研究高尿酸血癥的發病機理以及藥物篩選。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar 大鼠12只，雌雄各半，由中國醫學科學院醫學生物學研究所小動物實驗部提供，其生產許可證號：SCXK(滇)K2014-0002。使用許可證號：SYXK(滇)K2014-0007。實驗程序符合中國醫學科學院醫學生物學研究所動物實驗倫理委員會的要求，并遵守國際慣例，按照實驗動物使用的3R原則給以關懷。

1.2 試劑及儀器

逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)，RT-qPCR擴增試劑盒(SYBR Premix Ex TaqII (Tli RNaseH Plus)、RNA提取液(Tripure)，均購自Roche公司；氧嗪酸鉀(oxonic aid potassium salt，OA)，購自美國Sigma公司，純度≥97%；別嘌醇(allopurinol,ALLO)，購自南京都萊生物有限公司，純度≥98%；羧甲基纖維素鈉(Carboxy methyl cellulose sodium，CMC)，購自昆明誠悅科技公司；Biowest 瓊脂糖; DNA 分子量標準(DL 2000 bp)，購自TakaRa 生 物 工 程 有 限 公 司。CFX 96 TM real-time system 熒光定量 PCR 儀，購自美國Bio-Rad 公司;凝膠成像分析儀，美國 BioRad 公司; Power Pac Basic 電泳儀，購自北京六一生物工程有限公司; ND-1000 紫外 分光 光 度 計，購自美 國 Dano Drop 公司; 高速冷凍離心機，購自Sigma公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器，購于寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 引物設計及合成

引物設計以NCBI提供的大鼠XDH/XO核苷酸序列(017008.3)為參考，利用Primer5.0軟件在CDS區域進行設計。管家基因GAPDH：上游片段5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′下游片段5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，基因片段大小為143 bp；目的基因XDH/XO：上游片段5′-ATGCGGACCCTGAAACAACA -3′下游片段5′-TGTTCTGAAGACGGTCATACTTGGA -3′，基因片段大小為114 bp，均由寶生物TaKaRa生物有限公司合成。

1.4 RNA提取

脫頸處死Wistar大鼠，酒精棉球消毒腹部，迅速取出肝臟組織0.1 g于裝有1 mL tripure的5 mL EP管中，放入適合大小鋼珠，放入高速組織研磨器中充分研磨；靜置5 min，液體轉移至1.5 mL EP管中靜置5 min，加入200 μL -20 ℃預冷的氯仿，漩渦震蕩充分，靜置15 min后4 ℃，12 000×g離心25 min，吸取上清液450 μL于另一只1.5 mL EP管中，等體積加入-20 ℃預冷的異丙醇，充分混勻靜置10 min，4℃，12 000×g離心10 min，棄上清液，待管內壁稍干，加1 mL -20 ℃預冷的75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃，7 500×g離心5 min，棄上清液，待管內壁稍干，加入30 μL DEPC水溶解沉淀，65 ℃水浴10 min，得總RNA樣品。

1.5 RNA完整性及純度檢測

移取總RNA樣品2 μL于1.5%瓊脂糖凝膠孔中，在90 V，400 mA的條件下電泳20 min，于凝膠成像分析系統下觀察28S、18S 和5S RNA條帶，分析 RNA的完整性；再取1 μL于ND-1000紫外分光光度計測定RNA濃度。

1.6 RNA逆轉錄

測定濃度后每管按比例加DEPC水稀釋至1 000 ng/μL；總RNA按照逆轉錄試劑PrimeScriptTMRT reagent Kit說明操作，每10 μL體系中依次加入5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，總RNA 1 μL，RNaseFree dH2O 5.5 μL，逆轉錄條件為: 37 ℃，15 min，85 ℃，5 s；4 ℃，10 min，逆轉錄得到cDNA。

1.7 Wistar大鼠GAPDH基因及XDH/XO基因標準曲線的建立

以Esidilution 為溶劑梯度稀釋mDNA，分別稀釋為10-1，10-2，10-3,10-4倍濃度，以原始cDNA及稀釋后的cDNA為模板，各做2個平行樣進行RT-qPCR檢測：反應體系為25 μL。分別加XDH/XO基因及GAPDH基因上、下游引物各1 μL(10p)再分別加SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)12.5 μL及滅菌去離子水9.5 μL、cDNA 1 μL。反應條件為：94 ℃預變性30 s, 94 ℃變性5 s、59 ℃退火30 s、40個循環，59 ℃到94 ℃每5s采集一次熒光。反應完成后根據熒光信號的數據，使用CFXManager軟件，制作標準曲線，得到基因擴增效率，斜率及R2值，當XDH/XO基因及內參基因GAPDH基因擴增效率在80%至120%之間，R2值接近1，說明結果可信度較高，符合熒光定量 PCR要求。

1.8 OA致Wistar大鼠高尿酸血癥動物模型XDH/XO mRNA轉錄水平檢測

6只Wistar大鼠隨機分成3組，2只/組，第一組腹腔注射300 mg/kg劑量37.5 mg/mL濃度的OA，第二組腹腔注射300 mg/kg劑量OA和22 mg/kg劑量的ALLO，第三組腹腔注射1%的CMC-Na作為對照，于給藥1.5 h后脫頸處死動物，各組取肝臟0.1 g，放入已加1 mL tripure的5 mL EP管中。提取RNA，逆轉錄獲得cDNA，以cDNA為模板，做兩個平行樣進行實時熒光定量檢測，得到XDH/XOmRNA轉錄水平變化。

2 結果

2.1 RNA完整性及純度

Wistar大鼠肝臟組織提取總RNA進行電泳，可觀察到28S、18S、5S 三條帶，見圖1，說明所提取的總RNA無降解，可進一步用于后續實驗。所提取的總RNA樣品經Nanodrop-1000 超微量核酸測定儀測定波長260/280 nm的 吸光度A值,A260/A280值均介于1.8～2.0之間時，說明純度較高。

圖1 大鼠肝臟組織總RNA電泳圖Fig.1 The electrophoresis of total RNA from the liver tissue of rates

2.2 目的基因電泳結果

Wistar大鼠肝臟組織XDH/XO基因RT-qPCR產物經1.5%的瓊脂糖電泳，結果擴增出的目的條帶，與所設計的片段大小一致，且條帶較亮，表明擴增效率高，可用于后續實驗,見圖2。

圖2 XDH/XO mRNA RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 The electrophoresis result of RT-PCR of XDH/XO mRNA from the liver tissue of rates

2.3 Wistar大鼠肝臟GAPDH及XDH/XO基因標準曲線及溶解峰

由溶解峰圖可知大鼠GAPDH及XDH/XO基因純度較高，由標準曲線ct值可得各稀釋梯度cDNA的拷貝數，其中R2均接近1，說明以此標準曲線進行相對定量較準確，由于熒光強度均較強，故能保證熒光強度的增加與PCR的擴增相對同步，能準確檢測PCR的表達，見圖3、4。

2.4 OA致Wistar大鼠高尿酸血癥動物模型XDH/XO 基因轉錄水平的變化

以GAPDH為內源控制物，得到XDH/XO基因轉錄水平的變化，Wistar大鼠腹腔注射300 mg/kg劑量的OA組，肝臟組織XDH/XO基因轉錄水平較對照組上調；同時注射300 mg/kg劑量OA和22 mg/kg劑量的ALLO組，肝臟組織XDH/XO基因轉錄水平較300 mg/kg劑量的OA組下調，見圖5。實驗結果表明本文所建立方法能靈敏地檢測出Wistar大鼠高尿酸血癥動物模型XDH/XO基因轉錄水平的變化。

圖3 GAPDH基因標準曲線及溶解峰Fig. 3 The standard curves and melting curves of GAPDH gene

圖4 XDH/XO基因標準曲線及溶解峰Fig.4 The standard curves and melting curves of XDH/XO gene

圖5 OA致Wistar大鼠XDH/XO 基因轉錄水平的變化Fig.5 The change of stranscriptional-level of XDH/XO gene in Wistar rats after administration OA

3 討論與結論

RT-qPCR法是在 PCR 反應中可以結合于雙鏈 DNA 的小溝處并釋放出熒光信號。隨著反應的進行，靶基因的載量和熒光信號強度相對應，二者成一定的線性關系。所以通過收集熒光信號的強度，就可以間接來定量實驗中的雙鏈 DNA 的拷貝數[8-9]，具有操作簡單，造價便宜等優點，且熒光信號與 PCR 產物有相應的線性關系，所以可以實現實時監控、定量檢測目的基因的目的，目前廣泛用于基因方面研究，但也存在非特異性信號的干擾，所以選擇合適的樣品建立標準曲線對于檢測基因的表達尤為重要，當標準曲線的擴增效率在80%至120%之間，R2值接近1時，結果可信度較高，符合RT-qPCR要求[10]。本實驗從健康Wistar大鼠新鮮肝臟組織中提取總RNA，經逆轉錄獲得cDNA,梯度稀釋后進行RT-qPCR擴增，建立Wistar大鼠GAPDH基因和XDH/XO基因的標準曲線，實驗結果顯示，GAPDH基因和XDH/XO基因擴增效率分別為92.2%和93.4%，在80%至120%之間；R2值分別為0.995和0.993，接近1；且溶解峰曲線單一無雜峰，可有效地排除非特異性型號的干擾，說明標準曲線可信度較高，符合RT-qPCR要求，表明我們成功地建立了RT-qPCR檢測Wistar大鼠XDH/XO基因轉錄水平的RT-qPCR檢測方法。

自Johnson等成功地用OA誘導大鼠高尿酸血癥模型以來，因其靈敏、簡便、重復性好等特點成為了國內外高尿酸血癥造模的主要方法[11-13]。所以本實驗選用OA造模，誘導Wistar大鼠高尿酸血癥模型。目前對OA誘導動物高尿酸血癥模型的研究大多是代謝組學方面的研究[14-15],本實驗利用所建立方法對OA致Wistar大鼠高尿酸血癥動物模型XDH/XO基因轉錄水平的變化進行了研究，實驗結果表明OA會影響XDH/XO基因的轉錄水平，模型組的轉錄水平升高，與預期相符，同時也驗證了我們所建立的 RT-qPCR法測Wistar大鼠XDH/XO基因轉錄水平的方法是可行的，其可在轉錄水平上對高尿酸血癥動物模型的XDH/XO基因進行分析。

本實驗成功地建立了Wistar大鼠XDH/XO基因轉錄水平的RT-qPCR檢測法，該方法特異性強，靈敏度高，具有很好的重復性，可用于XDH/XO基因的定性和定量檢測，為高尿酸血癥動物模型的研究和高尿酸血癥發病機理以及新藥開發提供了可靠的手段。

致謝

感謝中國醫學科學院醫學生物學研究所小動物實驗部提供實驗動物及動物實驗飼養場地以及飼養動物。