不同劑量異丙腎上腺素致小鼠慢性心肌缺血模型的 制備及評價標準的建立*

朱竟赫 劉 馳 劉 禾 武曉琳 喬菊久 李 淼 范英蘭 包玉龍 齊 越 胡麗萍

(1. 遼寧省中醫藥研究院,沈陽 110034)(2. 遼寧中醫藥大學，沈陽 110847)

大、小鼠皮下大劑量注射異丙腎上腺素(ISO)能導致心肌缺血，與人的心肌缺血癥狀較為接近，是常用的、經典的抗心肌缺血作用評價模型，例如譚文明等[1]和焦淑萍等[2]分別利用ISO對大鼠和小鼠進行了心肌缺血模型的制備。但采用此法建立慢性心肌缺血模型的造模方法、造模劑量及評價指標尚缺少系統的試驗研究，文獻報道的方法繁多但無統一的、客觀的標準和依據。

ISO為β受體激動劑，可使心肌劇烈收縮而缺血缺氧,產生大量的ONOO-和氧自由基,對心肌細胞造成損傷[3]。Prabhu等[4]發現大劑量ISO可導致心肌線粒體組織蛋白酶-D和β葡萄糖醛酸酶活性顯著降低,心肌線粒體膜穩定性下降。當心臟負擔過重時也可導致心肌微循環障礙，引發缺血性病變[5]。大劑量注射ISO使腎素-血管緊張素-醛固酮系統被高度激活，可導致心功能進行性惡化并形成惡性循環[6]。因此，ISO成為使用頻率較高的經典的心肌缺血模型造模藥物之一。

本文采用不同劑量ISO對小鼠進行頸部皮下注射，建立小鼠慢性心肌缺血模型，觀測各模型組兩周內的心電圖、生化指標及病理指標的改變。通過比較確定最佳造模劑量，建立較為客觀、可靠的慢性心肌缺血模型的評價標準，為相關模型制備及藥效評價研究提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑；ISO：上海禾豐制藥有限公司，產品批號：101101，規格：2 mL:1mg；水合氯醛：國藥集團化學試劑有限公司，產品批號：20081120。

1.1.2儀器：ML785多導生理記錄儀：澳大利亞AD；AU5800型全自動生化分析儀：美國BECKMAN COULTER。

1.1.3動物：SPF級雄性KM小鼠，體質量18～22 g，購于遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(遼)2015-0001

1.1.4飼養環境：小鼠飼養于遼寧省中醫藥研究院(遼寧中醫藥大學附屬第二醫院)實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK(遼)2012-0003]，屏障環境，溫度：21～25 ℃,濕度45%～60%；動物自由采食和飲水，墊料每3日更換一次。顆粒飼料及玉米芯墊料，均由北京科澳協力飼料有限公司提供[實驗動物飼料生產許可證號：SCXK(京)2014-0010]。

1.2 方法

SPF級雄性KM小鼠160只，隨機分為4組，每組40只，分別為空白組(生理鹽水)、高劑量組(ISO，32 mg/kg體質量)、模型中劑量組(ISO，16 mg/kg體質量)、模型低劑量組(ISO，8 mg/kg體質量)。適應性飼養5 d后，腹腔注射4%水合氯醛，按每千克體質量0.4 g麻醉，Ⅱ導聯描記各組小鼠造模前心電圖。恢復性飼養3 d。各組按每千克體質量10 mL給藥，頸部皮下注射相應濃度的ISO(0.32%、0.16%和0.08%)，每日8:30定時注射，每日一次，連續造模3 d。末次注射ISO當晚禁食不禁水16 h，第二天麻醉前統計小鼠死亡率，末次注射ISO后24 h，每只小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，Ⅱ導聯描記造模24 h后心電圖。恢復性飼養待到末次注射ISO后第8天，每只小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，Ⅱ導聯描記造模后8 d心電圖，每組取10只小鼠眼眶采血1 mL，3 000 r/min離心10 min，吸取血清，AU5800型全自動生化分析儀檢測肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌鈣蛋白T(CTN-T)。引頸法處死后，摘取心臟甲醛固定, HE染色,光學顯微鏡觀察各組心肌形態學改變并拍照。其余小鼠恢復性飼養待到末次注射ISO后第15天，每只小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉，Ⅱ導聯描記造模后15 d心電圖，每只小鼠眼眶采血檢測生化指標；引頸法處死后，心臟HE染色并觀察病變情況。

記錄每只小鼠各個時間點的心電圖，采用LabChart8讀取T波高度，每只小鼠每個時間點連續4個波為1段取一個平均T波高度值，取3段的平均值作為該鼠該時間點的T波高度數值。

采用造模后24 h、8d及15 d心電圖的T波高度分別與該鼠造模前心電圖的T波高度做差并取其絕對值，得出造模后各時間點的T波變化量；然后以T波變化量除以該鼠造模前心電圖的T波高度，得出造模后各時間點的T波變化率[7]。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 心電圖

四組小鼠造模前、造模后24 h、造模后8 d及造模后15 d心電圖見圖1～4。各時間點T波高度、T波變化量及T波變化率見表1。

由表1可知，造模后各時間點T波高度均以自身造模前T波高度作為參照得出變化量及變化率，結果如下：各組造模后24 h、8d及15 d的T波高度較造模前均有所降低；中劑量組造模后24 h的T波高度顯著低于空白組(P<0.05)。高劑量組造模后15 d的T波變化量顯著高于空白組(P<0.01)；中劑量組造模后24 h、8d及15 d的T波變化量顯著高于空白組(P<0.01)。高劑量組造模后15 d的T波變化率顯著高于空白組(P<0.05)；中劑量組造模后24 h、8d的T波變化率顯著高于空白組(P<0.01)；中劑量組造模后15 d的T波變化率顯著高于空白組(P<0.05)。

圖1 空白組心電圖 Fig.1 Electrocardiogram of control group

圖2 高劑量組心電圖Fig.2 Electrocardiogram of high dose group

圖3 中劑量組心電圖Fig.3 Electrocardiogram of middle dose group

圖4 低劑量組心電圖Fig.4 Electrocardiogram of low dose group

項目空白組高劑量組中劑量組低劑量組造模前造模后24 h造模后8 d造模后15 d動物數/n40404040T波高度/mV0.19±0.080.20±0.030.21±0.060.21±0.06動物數/n40233035T波高度/mV0.14±0.060.11±0.100.05±0.13?0.10±0.11T波變化量/mV0.07±0.060.10±0.060.17±0.11??0.13±0.09T波變化率/%36.89±23.0053.67±35.9984.31±54.73??64.94±39.19動物數/n40233035T波高度/mV0.13±0.050.09±0.130.09±0.100.11±0.07T波變化量/mV0.06±0.060.12±0.070.15±0.10??0.11±0.06T波變化率/%34.19±22.6462.53±42.1677.02±51.92??48.69±26.50動物數/n30132025T波高度/mV0.09±0.050.04±0.070.07±0.110.12±0.07T波變化量/mV0.06±0.040.15±0.09??0.15±0.08??0.09±0.07T波變化率/%38.57±28.2282.10±55.46?71.55±37.00?40.20±23.89

注：與空白組相比*P<0.05,**P<0.01

Note: Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01

2.2 心肌損傷標志物

造模小鼠分別于造模后8 d、15 d進行眼眶采血，血清中心肌損傷標志物的檢測結果見表2、表3。

表2 造模后8 d的AST、CK、CK-MB、LDH及CTN-T數據Table 2 The data of AST、CK、CK-MB、LDH and CTN-T after 8 d of animal models

注：與空白組相比*P<0.05,**P<0.01

Note: Compared with the blank control group,*P<0.05,**P<0.01

高劑量組、低劑量組AST顯著高于空白組(P<0.05)；中劑量組AST極顯著高于空白組(P<0.01)。中劑量組CK極顯著高于空白組(P<0.01)。高劑量組、中劑量組CK-MB極顯著高于空白組(P<0.01)；低劑量組CK-MB顯著高于空白組(P<0.05)。高劑量組、中劑量組LDH極顯著高于空白組(P<0.01)。

表3 造模后15 d的AST、CK、CK-MB、LDH及CTN-T數據Table 3 The data of AST、CK、CK-MB、LDH and CTN-T after 15 d of animal models

注：*P<0.05,**P<0.01 vs空白組

Note: Compared with the blank control group,*P<0.05,**P<0.01

由表3可知，中劑量組、低劑量組AST極顯著高于空白組(P<0.01)。中劑量組CK極顯著高于空白組(P<0.01)。高劑量組、中劑量組、低劑量組CK-MB極顯著高于空白組(P<0.01)。高劑量組、中劑量組LDH極顯著高于空白組(P<0.01)；低劑量組LDH顯著高于空白組(P<0.05)。

2.3 病理

小鼠心肌HE染色切片結果見圖5～8。空白組小鼠心肌纖維粗細均勻，排列整齊，橫紋清楚，未見變性壞死，心肌間質亦無炎癥反應(圖5)；模型高劑量組各只小鼠心肌纖維大范圍變性，表現為心肌細胞界限不清，胞漿溶解成粉染顆粒狀，細胞核分布不均，核增大，可見核仁(圖6)；其中8 d 小鼠心肌纖維出現點灶狀壞死，較多淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤(圖7)；其中15 d 小鼠心肌間散在多灶性壞死區，間質水腫，血管充血，較多淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤(圖8)。

圖5 空白組小鼠心肌組織(HE,×400)Fig.5 The cardiac tissue in mice of black comparison group(HE,×400)

圖6 模型高劑量組小鼠心肌組織(HE,×400)Fig.6 The cardiac tissue in mice of high dose group(HE,×400)

圖7 模型高劑量組造模后8 d小鼠心肌組織(HE,×400)Fig.7 The cardiac tissue in mice of high dose group after 8 days(HE,×400)

圖8 模型高劑量組造模后15 d小鼠心肌組織(HE,×400)Fig.8 The cardiac tissue in mice of high dose group after 15 days(HE,×400)

2.4 死亡率

各組小鼠按相應劑量皮下連續3 d注射ISO后剩余動物數及死亡率見表4。

表4 造模前后動物的剩余數量及死亡率Table 4 The Remaining number and death rate of animals before/after animal models

由表4可知造模后高劑量組剩余動物23只，死亡率為42.5%；中劑量組剩余動物30只，死亡率為25%；低劑量組剩余動物35只，死亡率為12.5%。

3 討論

目前，大、小鼠慢性心肌缺血模型的造模方法、造模劑量及評價指標尚缺少系統的試驗研究，文獻報道的方法繁多但無統一的、客觀的標準和依據。本文認為，慢性心肌缺血模型的是否成模標準，應根據其所應用的試驗時間而定，此模型若能在受試藥物較長的給藥期間內維持穩定即可判斷此模型成功。通過查閱文獻[8-10]很大一部分治療心肌缺血的藥效學試驗給藥時間均不超過15 d，本試驗針對此情況設計觀察8 d和15 d，這個時間長度基本可以滿足大部分治療給藥試驗周期的需求。指標選擇上采用ECG、心肌酶譜、肌鈣蛋白及病理觀察，涵蓋了很大一部分試驗的常規需求[11-14]。

本實驗以小鼠作為試驗對象，一般小鼠ECG特點為無明顯ST段，S波與T波直接平滑相連，人工測量ST段及J點主觀性較強。故以T高度作為考察指標，影響因素較少，準確度較高，更加客觀。結果顯示連續3 d皮下注射ISO 16 mg/kg 的劑量組在造模后24 h、8 d、15 d ECG的T波高度均發生較為顯著的變化；連續3 d皮下注射ISO 32 mg/kg 的劑量組在造模15 d時T波高度變化較為顯著；而連續3 d皮下注射ISO 8 mg/kg 的劑量組各個時間T波高度均無顯著變化。這說明連續3 d皮下注射ISO 32 mg/kg 和16 mg/kg的劑量都能造成小鼠較持久的心肌缺血癥狀。而8 mg/kg 的劑量效果不顯著。ISO 16 mg/kg 劑量組的ECG在24 h、8 d時T波高度變化較為顯著，而ISO 32 mg/kg 劑量組在24 h、8 d時T波高度變化反而不顯著，可能是由于ISO 32 mg/kg 劑量組死亡率較高，一些癥狀嚴重的個體死亡了，而ISO 16 mg/kg 劑量組反而保留下一些癥狀嚴重的個體，導致ECG變化顯著。三個劑量組在造模后8 d、15 d時，心肌酶譜相對空白組均有顯著性差異，如果單純考察心肌酶譜，這三個劑量均可使用；只有ISO 32 mg/kg 的劑量組在造模后8 d、15 d出現可見的心肌病理變化。本試驗采用16 mg/kg劑量的死亡率為25%，8 mg/kg劑量的死亡率僅為12.5%，而相比其他文獻報道[15]使用8 mg/kg 劑量的死亡率就已達到33.3%。原因可能和操作有關。

目前常見一些實驗采用大鼠尾靜脈注射ISO或垂體后葉素(PIT)造成急性心肌缺血模型[16-17]，本實驗旨在制備慢性心肌缺血模型，不追求使藥物第一時間達到最大血藥濃度，短時間血藥濃度過高亦可以造成動物死亡率過高，因而未采用靜脈注射，而是采用皮下注射的方式。大鼠皮下多點注射ISO是制備慢性心肌缺血的常用方法，但根據預實驗發現，大鼠對ISO的耐受程度遠低于小鼠，死亡率較高，有關大鼠的研究情況將在后續文章中進行報道。

心肌缺血的表現不僅在于 ECG 的異常,還涉及到一些酶學指標的變化。傳統的心肌酶譜包括AST(生物半衰期20 h，18～36 h達峰，3～4 d恢復正常)、CK(生物半衰期17 h，12～24 h達峰，3～4 d恢復正常)、CK-MB(生物半衰期13 h，12～24 h達峰，2～3 d恢復正常)、LDH(生物半衰期110 h，48～72 h達峰，7～14 d恢復正常)用以評估心肌細胞性損傷, 其中AST和LDH廣泛存在于全身各組織中，單獨的AST或LDH升高并不能確認為心肌損傷，必須結合心電圖以及CK、CK-MB等指標聯合判斷；CK是心肌細胞中重要的能力調節酶，由M和B 兩個亞基組成，形成CK-MM、CK-MB和CK-BB三種同工酶；其中CK-BB主要存在于腦組織中，CK-MM主要存在于骨骼肌中，而CK-MB主要存在于心肌中，故CK-MB特異性最高[18]。CTN-T(生物半衰期2 h，12～96 h達峰，7-14 d恢復正常)是收縮蛋白中調節蛋白的重要部分，是CTN與原肌球蛋白結合的部分，其在心肌中的含量較高，而正常人的血液中幾乎檢測不到CTN-T，對急性心肌梗死有較高的分辨能力[19]。本試驗設計的考察時間為8 d和15 d，其中8 d超過了AST、CK、CK-MB的恢復時間，15 d超過了上述所有標志物的恢復時間。皮下注射ISO 32 mg/kg、16 mg/kg 及8 mg/kg，8 d及15 d后動物血液中的CK-MB較空白組均有顯著性差異，無論是8 d還是15 d均遠超過了CK-MB的恢復時間，這說明這三個造模劑量均能造成心肌的持續損傷。而皮下注射ISO 16 mg/kg劑量組在15 d仍能夠保持AST、CK、CK-MB、LDH顯著升高，說明該劑量持續造成心肌損傷效果較好。

從心電圖及心肌損傷標志物的結果來看，中劑量組的心電圖改變和心肌損傷均比高劑量組嚴重，但其死亡率僅為25%，較高劑量組的死亡率42.5%大幅降低。我們推測是由于高劑量組一些小鼠無法耐受而死亡，中劑量組則因為劑量相對較低死亡率大幅降低，因而保留的一部分癥狀較重的小鼠。中劑量組死亡率與心電圖及心肌損傷標志物改變達到了相對較好的平衡。

從病理結果來看，高劑量組造模后8 d及15 d的小鼠心肌均出現明顯病理變化，可見以ISO 32 mg/kg造模可在8 d、15 d內造成病理性損傷，形成心肌的壞死性炎癥反應。中劑量組、低劑量組鏡下均未發現明顯病理改變。

綜上所述，小鼠連續3 d皮下注射ISO 32 mg/kg或ISO 16 mg/kg均能造成慢性心肌缺血模型，可在心電圖、心肌損傷標志物及病理形態三方面均產生顯著改變。此模型造模方法簡便，維持時間長，適合抗慢性心肌缺血藥物較長期治療給藥的藥效評價。而ISO 16 mg/kg的造模劑量死亡率較低并且在心電圖與心肌損傷標志物的指標上優于ISO 32 mg/kg，但并未造成心臟明顯病理性損傷。提示可根據不同試驗預期選擇性地采用2個不同造模劑量建立小鼠慢性心肌缺血模型。