半夏瀉心湯對衰老大鼠學習記憶能力的改善及分子機制*

彭 旭 張曉梅 何學令 劉 艷

(四川大學實驗動物中心，成都 610041)

人在自然衰老過程中，隨著年齡的增長會出現記憶力減退、反應遲鈍、認知功能下降等腦功能障礙癥狀。學習記憶是大腦的重要功能之一，而學習記憶的作用機制與中樞膽堿能神經系統、單胺類神經遞質NE、DA、5-HT密切相關，它們之間相互制約且處于一種平衡狀態[1]。半夏瀉心湯(BXT)源自張仲景《傷寒雜病論》，本方攻補兼施、升降并用，其辛開、苦降、甘補的組方配伍，一直以來是基礎研究及臨床應用的熱點復方之一[2]。在我們的前期研究中發現，BXT及其拆方可通過影響脾虛大鼠下丘腦中NE、DA、5-HT神經遞質的水平，調節大鼠的脾胃功能[3]。渡邊雄泰[4]等研究表明BXT對應激性潰瘍不僅直接作用于消化系統，而且通過介導腦內情感系統的中樞抑制作用而發揮治療效果。張忠等[5]研究BXT及其拆方對應激性胃潰瘍大鼠膽堿能神經元的影響，結果顯示BXT全方組及各拆方組除作用于胃黏膜本身引起胃黏膜本身分泌改變之外，還影響到腦的分泌功能。上述研究表明，BXT的作用機制與腦內的神經遞質有一定的關系。此外，根據中醫理論，BXT是辛開苦降的代表方劑，對梳理脾胃氣機之升降，調節全身氣機之運行，非常合乎老年人精氣不足的體質特點，因此推測BXT對于抗衰老有一定的作用。本研究旨在分子水平上研究半夏瀉心湯對衰老大鼠大腦海馬區Ach、NE、DA、5-HT受體mRNA表達的影響，對其可能的作用機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠120只，SPF級，雌性，體質量(400±20)g，15月齡。另取10只SD大鼠，SPF級，雌性，體質量(200±100)g，6月齡，作為壯年對照組。實驗動物均由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(川)2013-19；動物實驗在四川大學實驗動物中心完成，實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2015-185。

1.2 藥品與試劑

根據《傷寒論》BXT全方組成為半夏12 g，干姜9 g，黃芩9 g，黃連3 g，人參9 g，炙甘草9 g，大棗4枚。以上中藥飲片均購于四川省中藥飲片有限責任公司，大棗自配。用蒸餾水常規煎煮2次，加熱濃縮成每1 mL提取液中含1 g生藥，置4 ℃冰箱儲存備用。石杉堿甲片(河南太龍藥業股份有限公司，批號:130904)使用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配成0.3%的溶液備用。D-半乳糖(上海金穗生物科技有限公司)；Trizol(Ambion公司)、逆轉錄試劑盒(Thermo)；CHRM1、DRD2、HTR1a、ADRA2a基因引物(成都寶信生物有限公司)；一抗，二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒[基因科技(上海)有限公司]。

1.3 儀器設備

MultiGene Optimax PCR儀(Labnet)；JY600C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；超純水系統(Milipore)；顯微鏡及圖像采集系統(Olympus)；切片機(Leica)；Autostainer 480 s全自動免疫組化儀(Thermo)；Y型水迷宮(自制)。

1.4 實驗方法

1.4.1大鼠衰老模型建立：將120只15月齡大鼠進行Y型水迷宮測試，記錄大鼠平均逃避潛伏期(從入水起點至尋找到階梯出水的時間)和正確反應次數(以10 s內直接抵達平臺為正確反應)[6]，每次測定時間為2 min，2min后仍未找到安全通道者以120 s計算。每只大鼠每天訓練2次，共訓練2 d。獲得性訓練結束后，正式進行測試，每只鼠每天測試1次，共3 d。

根據大鼠的逃避潛伏時間由高到低，篩選出學習記憶能力明顯較弱的動物50只，隨后在大鼠頸部皮下注射D-半乳糖125 mg/kg體質量[7]，每天1次，連續給藥4周。4周后再次進行Y型水迷宮測試，未通過測試大鼠，即為老齡模型大鼠。

1.4.2實驗動物分組及給藥：將老齡模型大鼠隨機平均分為5組，根據治療藥物類型和劑量，分別為老齡對照組(生理鹽水)、石杉堿甲組(作為藥物治療的陽性對照組)、BXT高劑量組、BXT中劑量組、BXT小劑量組。另選10只6月齡正常大鼠作為壯年對照組。

BXT組大鼠根據不同BXT劑量進行灌胃給藥，BXT高劑量組10 mL/kg、中劑量組5 mL/kg、低劑量組2.5 mL/kg，石杉堿甲組30 mg/kg體質量，壯年對照組和老齡對照組灌胃生理鹽水10 mL/kg。大鼠每周測體質量一次，按體質量調整給藥劑量，連續給藥6周。

1.4.3病理學及免疫組化檢測：行為學檢測結束后，各組大鼠放入4%異氟烷的誘導盒中進行誘導麻醉。大鼠進入麻醉狀態后迅速取出，并行眼眶放血處死，打開頭蓋骨，迅速取出腦組織，于冰上剝離左側大腦皮層和海馬，置于4%多聚甲醛中固定。將腦組織塊冠狀位連續切片，片厚5 μm。每隔5張取1張，每例動物相鄰切片分為3套，每套各5張，選取其中一套進行常規HE染色，樹脂封片，進行組織病理學檢測。另一套采用Envision二步法進行免疫組織化學染色。

1.5 Real-time PCR 檢測Ach、NE、DA、5-TH受體mRNA表達

根據GenBank的序列，用Goldkey軟件分別設計CHRM1、DRD2、HTR1a、ADRA2a基因的引物。根據RNA提取試劑盒說明書提取RNA，然后根據Thermo的逆轉錄試劑盒合成cDNA，最后進行PCR擴增。引物序列如下：

CHRM1上游引物5’-ATACAGTCAAGAGGC CCACC-3’；

下游引物5’-AGGAACACAGTCCTTGCAGA-3’，產物長度218 bp；

DRD2 上游引物5’-AAACCCGGACCTCC CTTAAG-3’；

下游引物5’-AGAGGACTGGTGGGATGTTG-3’，產物長度113 bp；

HTR1a 上游引物5’-ACCTCTCTGTTGCTG GGTAC-3’；

下游引物5’-CGATAAACAGGTCGCAGGTG-3’，產物長度719 bp；

ADRA2a上游引物5’-TTGGCCTTGTCGCGAT ATTG-3’；

下游引物5’-CCAGGGGACAGTTACCAGTT-3’，產物長度75 bp；

1.6 圖像分析及數據處理

使用Olympus顯微鏡及圖像采集系統對海馬區Ach、NE、DA、5-TH受體陽性細胞進行采圖。應用凝膠成像分析軟件Gel-Pro-analyzer4.0分析受體和內參β-Actin的灰度值，并用GraphPad Prism軟件做柱狀圖進行比較。

2 結果

2.1 Y型水迷宮檢測各組大鼠學習記憶能力

造模后，老齡對照組大鼠在Y型水迷宮中的逃避潛伏期較壯年對照組明顯延長；與老齡對照組比較，在訓練后24 h、48 h和96 h，各劑量BXT給藥組均能明顯縮短衰老大鼠逃避潛伏期，結果見圖1。

2.2 海馬區病理形態學觀察

對各組大鼠海馬區組織進行HE染色，結果如圖2所示。壯年對照組海馬組織各區顯示清晰，神經元細胞豐富，數量較多，排列整齊，細胞形態正常，核大而圓，核仁明顯，可見少量小膠質細胞，神經纖維清晰；老齡對照組可見海馬各區神經元細胞不同

圖1 BXT對大鼠逃避潛伏期的影響Fig.1 Effect of BXT on escape latency of rats

程度減少，出現神經元萎縮(紅色神經元)，小膠質細胞增生、血管套以及噬神經現象；BXT高劑量組和石杉堿甲組海馬神經元損傷均有所改善，改善程度基本相同，但BXT中劑量組和低劑量組同老齡對照組相比未見明顯改善。

圖2 海馬區HE染色觀察(×200)注：a：老齡對照組；b：石杉堿甲組；c：壯年對照組；d：BXT低劑量組；e：BXT中劑量組；f：BXT高劑量組Fig.2 HE staining of hippocampus(×200)Note:a:aging control group;b:huperzine A group;c:strong control group; d:BXT low dose group,e:BXT medium dose group;f:BXT high dose group

2.3 免疫組織化學染色結果

對大鼠海馬區組織進行免疫組化染色，各組大鼠海馬區DRD2、CHRM1、HTR1α、ADRA2α的表達和分布情況如圖3～6所示。椎體細胞的細胞膜和細胞質內出現了深棕色的陽性細胞染色反應，而椎體細胞周圍未見其他細胞有著色。從形態結構看，壯年對照組海馬區椎體細胞染色數量多且顏色深，排列緊密整齊，層次結構明顯；老齡對照組海馬區椎體細胞染色數量少且顏色很淺，排列疏松，細胞間隙較大，層次結構不明顯；BXT高劑量組和石杉堿甲組椎體細胞染色數量和顏色以及排列緊密度介于壯年對照組和老齡對照組之間，對受體的表達有明顯的增強作用，結構層次也有改善，這說明高劑量BXT對海馬區的損傷有一定的保護作用，保護程度與石杉堿甲組類似，但中劑量組和低劑量組椎體細胞的陽性反應程度與老齡對照組相比未見明顯差異。

2.4 BXT對大鼠海馬區CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α mRNA表達的影響

mRNA表達結果顯示，BXT低劑量組和中劑量組的CHRM1、DRD2、ADRA2α mRNA相對表達量均低于大劑量組，而HTR1α mRNA相對表達量在BXT各組中表達量差異不明顯；壯年對照組的CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α mRNA相對表達量均高于其余五組，而老齡對照組偏低，尤其在CHRM1和HTR1α mRNA表達量上顯著低于其它組。見圖7和圖8。

圖3 海馬區DRA2表達情況(深棕色，×200)注：a：老齡對照組；b：石杉堿甲組；c：壯年對照組；d：BXT低劑量組；e：BXT中劑量組；f：BXT高劑量組Fig.3 Expression of DRA2 in hippocampus (dark brown,×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group;d:BXT low dose group; e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

圖4 海馬區CHRM1表達情況(×200)注：a：老齡對照組；b：石杉堿甲組；c：壯年對照組；d：BXT低劑量組；e：BXT中劑量組；f：BXT高劑量組Fig.4 Expression of CHRM1 in hippocampus(×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group; d:BXT low dose group;e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

圖5 海馬區ADRA2α表達情況(×200)注：a：老齡對照組；b：石杉堿甲組；c：壯年對照組；d：BXT低劑量組；e：BXT中劑量組；f：BXT高劑量組Fig.5 Expression of ADRA2α in hippocampus (dark brown,×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group; d:BXT low dose group;e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

圖6 海馬區HTR1α表達情況(×200)注：a：老齡對照組；b：石杉堿甲組；c：壯年對照組；d：BXT低劑量組；e：BXT中劑量組；f：BXT高劑量組Fig.6 Expression of HTR1α in hippocampus(×200)Note:a:Aging control group;b:Huperzine A group;c:Strong control group; d:BXT low dose group;e:BXT medium dose group:f:BXT high dose group

圖7 海馬區DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA表達的影響注：a：BXT低劑量組；b：BXT中劑量組；c：BXT高劑量組； d：石杉堿甲組；e：壯年對照組；f：老齡對照組Fig.7 Expression of DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA in hippocampusNote: a:BXT low dose group; b:BXT medium dose group; c:BXT high dose group;d: Huperzine A group; e: Strong control group;f: Aging control group

圖8 海馬區DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA相對表達量Fig.8 Relative expression of DRD2、CHRM1、HTR1α、 ADRA2α mRNA in hippocampus

3 討論

哺乳動物隨著年齡的增加，海馬區的形態結構、功能以及一些相關蛋白質分子發生改變，被認為是海馬功能衰退的基礎。在本次實驗中通過大鼠行為學試驗，我們發現經高劑量BXT治療過的老年大鼠能夠明顯縮短逃避潛伏期，與老齡對照組相比，差異極顯著(P<0.01)。HE染色和免疫組化染色結果都顯示，BXT大劑量組的海馬區受損的神經元也有所改善。這提示BXT對老年鼠的海馬區受損部位有一定程度的改善作用。

NE在記憶保持方面起重要作用，而改善記憶與促進DA的釋放有關，5-HT則與精神活動、感覺體溫調節、高級認知功能有關。當機體逐漸衰老后，腦內單胺類神經遞質亦發生代謝紊亂，表現為NE、DA和5-HT含量下降，其含量下降是造成學習記憶能力減退的重要原因[6，8]。陳喬等用放射自顯影方法研究表明，老年大鼠大腦皮質及海馬部位CHRM1密度顯著低于壯年對照鼠，并提出這3個腦區 CHRM1受體密度的降低可能是衰老時學習、記憶、聯想、認知等功能障礙的重要機制之一[9]。Wilkerson and Levin[10]研究發現，腹側海馬注入DRD2激動劑可提高大鼠工作記憶的能力，相反注入DRD2受體拮抗劑則降低工作記憶的能力，故提示了DRD2參與記憶功能。梁發權和呂寶璋[11]采用放射性配基結合分析法發現老年大鼠(36月齡)大腦皮質中5-HT受體的數目較成年大鼠(3月齡)明顯減少，提示老年鼠中樞5-HT系統的功能降低，可能與老年期的一些表現如記憶力衰退、睡眠障礙有關。本實驗觀察到，模型組的CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α mRNA表達明顯弱于壯年組，甚至出現一些無表達現象，這與其他學者的研究結果是一致的，衰老時會出現中樞學習、記憶力以及認知等功能的下降，這與大腦海馬區Ach、NE、DA、5-TH受體mRNA表達下降的現象有密切關系。

石杉堿甲是一種強效的可逆性膽堿酯酶抑制劑，并可增強大鼠海馬CA1錐體神經元的興奮性突觸傳遞，其增強突觸傳遞作用與M型乙酰膽堿受體激動有關[12]。BXT高劑量組與石杉堿甲組的CHRM1、DRD2、ADRA2α mRNA表達趨于一致性，這說明高劑量BXT對海馬區的損傷有一定的保護作用，保護程度與石杉堿甲組類似。另外，有研究報告表明膽堿酯酶抑制劑通過M1型膽堿能受體能夠使行為大鼠CA1區的長時程增強[13-14]。在我們之前的研究中發現，半夏瀉心湯給藥組可明顯上調腦組織膽堿能受體M1的表達[15-16]，故我們推測BXT抗衰老的作用機制與CHRM1、DRD2、HTR1α、ADRA2α基因表達有關，BXT可以激活其mRNA的表達，從而對衰老大鼠腦組織中Ach、NE、DA、5-TH起到一定的調節作用。由于中藥的作用是多靶點、多效應作用的結果，因此在接下來的工作中還要再進一步對BXT參與機體抗衰老的作用機制進行研究。