昆明小鼠放射性肺炎病理觀察

楊 鈐 馮瑪莉 朱麗娜 仝立國

(山西省中醫藥研究院臨床藥理研究室，太原 030002)

放射性肺損傷是胸部腫瘤放療、骨髓移植等預處理后常見的并發癥，嚴重時加速患者死亡[1]。病程可分為早期急性肺炎和晚期放射性肺纖維化2期[2]。本研究模擬臨床放療條件，制備昆明小鼠放射性肺炎模型，闡明疾病發生發展過程肺部病理變化，為中藥治療奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本(對象)選擇及分組

昆明小鼠，雌雄各半，5周齡，體質量為(20±2)g，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：[SCXK(京)2014-0004]。動物飼養條件：同時分籠飼養于山西省中醫藥研究院中心實驗室，自然光照，自由進水，室內溫度18～29 ℃，濕度36%～60%。

將實驗小鼠隨機分為4組：空白對照組以及模型組照射后7th、14th、28th 3組。每組10只，雌雄各半。

1.2 模型制備

動物經3%戊巴比妥麻醉后，采用6MV的X射線20Gy單次全胸照射(圖1)造模，照射位置為頭部下方、劍突以上，照射野面積2 cm×3 cm，劑量率：2 Gy/min，放射源距皮100 cm。空白組不做任何處理。

圖1 6MV的X射線20Gy單次全胸照射， 放射源距皮100 cmFig.1 20 Gy cumulative dose of 6MV X-ray irradiation of full chest once, and source-skin distance=100 cm

1.3 取材及常規病理觀察

分別于照射后第7、14、28天后殺檢取材，肺臟經宏觀觀察后，與心臟一起包入紗布中置于10%中性甲醛溶液進行固定。取左肺葉和右肺中葉，常規脫水、石蠟包埋、切片后，經HE染色后顯微鏡下觀察肺臟組織病理學形態改變。

1.4 HE染色步驟

二甲苯I-1 10 min→二甲苯I-2 10 min→二甲苯I-3 10 min→無水乙醇I 5 min→95%乙醇 I 5 min→75%乙醇I 5 min→蘇木素 4 min→自來水清洗→0.5%鹽酸 5 s→自來水清洗→1%氨水 5 s→自來水清洗→伊紅 2 min→75%乙醇II 5 s→85%乙醇 5 s→95%乙醇II 5 s→無水乙醇II 10 min→二甲苯II-1 10 min→二甲苯II-2 10 min→二甲苯II-3 10 min[3]。

1.5 圖像分析

采用Image Pro Plus圖像分析系統檢測組織切片中肺泡壁厚度、肺泡腔面密度(肺泡腔面積/視野單位面積)、肺間質面密度(肺間質面積/視野單位面積)[4]。每張切片隨機選取5個視野測量。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 照射后KM小鼠臨床表現

照射3 d后，KM小鼠背部胸段照射野被毛脫落，狀態萎靡。

2.2 組織病理學形態變化

空白對照組肺實質與間質部分病理組織學結構均正常(圖2-A)。模型組照射7 d后可見輕度肺炎，肺泡間隔增寬、少量炎細胞浸潤(圖2-B)。照射14 d后表現為輕-中度肺炎，肺泡塌陷，炎細胞浸潤肺泡間隔，破壞肺泡結構，輕度滲出(圖2-C)。照射4周后可見重度肺炎，肺泡塌陷實變，炎細胞大量浸潤，輕度纖維化改變，毛細血管充血，氣管支氣管上皮雜亂、脫落(圖2-D)。

圖2 組織病理學形態變化 HE ×100注：A： 空白對照組；B： 20Gy照射后7 d；C： 20Gy照射后14 d；D： 20Gy照射后4周Fig.2 Lung histopathological changes HE×100Note:A: Blank control group; B: 7 d after 20Gy irradiation; C: 14 d after 20Gy irradiation; D: 4 weeks after 20Gy irradiation

2.3 定量測定

正常對照組與模型組肺泡壁厚度、肺泡腔面密度、肺間質面密度變化見表1。照射20Gy后，隨時間延長，肺泡壁增厚，第7、14、28天測量結果差異顯著(P<0.01)；肺泡腔萎縮，面積減小，第7天后差異顯著(P<0.05)，第14、28天后差異極顯著(P<0.01)；肺間質增寬，面積增大，第14、28天后測量差異極顯著(P<0.01)。

表1 肺泡壁厚度、肺泡腔面密度、肺間質面密度測量結果Table 1 The determination of thickness of alveolar walls and surface mass density of alveolar spaces and interstitial tissue

注：*P<0.05；**P<0.01

Note：*P<0.05 vs control,**P<0.01 vs control

3 討論

放射性肺炎系由肺癌、食管癌、乳腺癌或胸部其他惡性腫瘤經放射治療后,在放射野內的正常肺組織受到損傷而引起的炎癥反應，該病的發生率為5%～50%，嚴重肺炎發生率為10%～20%，病死率高達50%[5]。盡管近年來治療手段不斷進步,尤其是中醫辨證治療放射性肺炎具有較好的療效[6]，但是該病的發生率仍高達30%。放射性肺炎的發生發展對機制研究及防治措施的優化至關重要，綜合遺傳背景、研究費用及操作難易程度等因素，選擇昆明種小鼠作為實驗動物[7-8]。模擬臨床放療條件建立放射性肺炎模型，闡明放射性肺炎發生發展過程的病理變化。

參照周仟等、白蘊紅等[9-10]方法，采用6MV的X線單次大劑量20Gy照射復制小鼠放射性肺損傷模型，分別于照射后第7、14、28天，觀察小鼠一般體征，并進行病理HE染色觀察。射線照射3 d后出現活動減少、精神萎靡、體質量減輕、胸背部脫毛等狀況。此外，隨著觀察時間的延長，肺泡，肺間質均出現進行性病變，通過實驗發現，6MV的X線20Gy輻照對肺部病變有明顯影響。昆明小鼠輻照第7天后，肺間質增寬，炎細胞輕度浸潤；輻照第14天后，肺泡塌陷，肺間質進一步增厚，炎細胞浸潤明顯，紅細胞輕度滲出，表明肺部病變已初步出現；而輻照第28天后，肺泡萎縮實變，炎細胞大量浸潤，毛細血管充血，氣管支氣管上皮雜亂、脫落，出現輕度纖維化改變，表明肺部病變已經非常明顯。此外，通過統計學定量分析結果，顯示輻照第14、28天后肺泡壁厚度、肺泡腔面積、肺間質面積變化極顯著(P<0.01)。本次實驗主要偏向于從宏觀、表觀方向選擇表征放射性肺炎病變的關鍵指標，如肺泡壁厚度、肺泡腔面積、肺間質面積等進行觀察描述，下一步應從分子生物學角度對放射性肺炎的病理機理予以進一步觀察和驗證。綜上所述，病理學研究結果符合放射性肺炎的病變規律[8]，可用于進一步藥理研究。