Tim-3/Galectin-9在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)變化及臨床意義探討

蘭勇 陳明 邢人偉

[摘要] 目的 探討T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白-3（T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）/半乳糖凝集素-9（Galectin-9）在原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）中的表達(dá)變化及臨床意義。 方法 回顧性分析2014年6月～2016年6月收治的110例接受根治性切除術(shù)的PLC患者的臨床資料。檢測(cè)并對(duì)比肝癌組織及癌旁組織中Tim-3、Galectin-9表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)Tim-3、Galectin-9不同表達(dá)情況時(shí)患者病理參數(shù)、隨訪1年內(nèi)復(fù)發(fā)和死亡情況。 結(jié)果 肝癌組織中Tim-3陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織（P<0.05），肝癌組織中Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織（P<0.05）;Tim-3、Galectin-9陽(yáng)性組與陰性組性別、年齡、肝硬化、血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、病理分型、TNM分期患者構(gòu)成比比較差異不顯著（P>0.05），Tim-3陽(yáng)性組腫瘤直徑≥5 cm、多發(fā)病灶、血管侵犯、無(wú)腫瘤包膜患者構(gòu)成比顯著高于陰性組（P<0.05），Galectin-9陽(yáng)性組腫瘤直徑≥5 cm、多發(fā)病灶、血管侵犯、無(wú)腫瘤包膜患者構(gòu)成比顯著低于陰性組（P<0.05）;術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)和死亡患者中Tim-3陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于未復(fù)發(fā)和存活患者（P<0.05）;復(fù)發(fā)和死亡患者中Galectin-9表達(dá)率顯著低于未復(fù)發(fā)和存活患者（P<0.05）。 結(jié)論 Tim-3的高表達(dá)、Galectin-9低表達(dá)與PLC多種病理學(xué)特征有關(guān)，且復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)、死亡與存活患者中Tim-3、Galectin-9蛋白表達(dá)存在差異，可能成為臨床中評(píng)估PLC患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

[關(guān)鍵詞] T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白-3;半乳糖凝集素-9;原發(fā)性肝癌;復(fù)發(fā);死亡

[中圖分類號(hào)] R735.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）04-0049-05

[Abstract] Objective To investigate the expression changes and clinical significance of T cell immunoglobulin mucin-3（Tim-3）/Galectin-9 in primary liver cancer（PLC）. Methods The clinical data of 110 PLC patients who underwent radical resection from June 2014 to June 2016 were retrospectively analyzed. The expressions of Tim-3 and Galectin-9 in liver cancer tissues and adjacent tissues were detected and compared. The pathological parameters， the recurrence and death within 1 year of follow-up of patients with different expressions of Tim-3 and Galectin-9 were analyzed. Results The positive expression rate of Tim-3 in liver cancer tissue was significantly higher than that in adjacent tissues（P<0.05）. The positive expression rate of Galectin-9 in liver cancer tissue was significantly lower than that in adjacent tissue（P<0.05）. There was no significant difference in gender， age， liver cirrhosis， serum alpha-fetoprotein（AFP）， hepatitis B surface antigen（HBsAg）， pathological type， and the composition ratios of TNM staging in Tim-3 and Galectin- 9 positive and negative groups（P>0.05）. The composition ratio of tumor diameter ≥5 cm， multiple lesions， vascular invasion， no tumor capsules in Tim-3 positive group was significantly higher than that in the negative group（P<0.05）. The composition ratio of tumor diameter ≥5 cm， multiple lesions， vascular invasion， and tumor-free capsule was significantly lower than that of the negative group（P<0.05）. The positive rate of Tim-3 expression in patients with recurrence and death within 1 year after surgery was significantly higher than that in patients without recurrence and survival（P<0.05）. The expression rate of Galectin-9 was significantly lower in patients with relapse and death than that in patients without recurrence and survival（P<0.05）. Conclusion The high expression of Tim-3 and the low expression of Galectin-9 are related to various pathological features of PLC， and there are differences in the expression of Tim-3 and Galectin-9 in patients with recurrence and non-recurrence， and in death and survival patients. They may become one of the important indicators for evaluating the prognosis of PLC patients.

[Key words] T cell immunoglobulin mucin-3; Galectin-9; Primary liver cancer; Recurrence; Death

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高[1]。由于早期無(wú)癥狀或癥狀不明顯，確診時(shí)多數(shù)患者已至局部晚期或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，治療難度增加且預(yù)后差，術(shù)后1年復(fù)發(fā)率超過(guò)30%，而術(shù)后5年生存率不足10%，給人們的健康和生命造成嚴(yán)重威脅[2]。隨著分子生物學(xué)研究逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中起重要作用。T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白-3（T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3）是一種優(yōu)勢(shì)表達(dá)于Ⅰ型輔助性T淋巴細(xì)胞（type Ⅰ helper T lymphocyte，Th1）表面的特異性表面標(biāo)志物，通過(guò)Tim-3/半乳糖凝集素-9（Galectin-9）信號(hào)通路調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡，進(jìn)而參與腫瘤進(jìn)展[3-4]。但Tim-3、Galectin-9在PLC中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響鮮有報(bào)道。鑒于此，本研究回顧性分析我院收治的PLC患者的臨床資料，通過(guò)分析Tim-3、Galectin-9在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料

回顧性分析2014年6月～2016年6月收治的110例接受根治性切除術(shù)的PLC患者的臨床資料，其中男72例，女38例，年齡38～72歲，平均（51.35±6.80）歲，肝硬化91例，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽(yáng)性98例，腫瘤直徑<5 cm者73例、≥5 cm者37例，病理分型[5]：肝細(xì)胞癌99例、膽管細(xì)胞癌9例、混合癌2例，美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)TNM分期[6]：Ⅰ～Ⅱ期者82例、Ⅲ～Ⅳ期者28例，單發(fā)病灶76例、多發(fā)病灶34例。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)? （1）病理學(xué)確診為PLC;（2）行根治性切除術(shù)，術(shù)后組合考慮接受輔助放化療;（3）隨訪時(shí)間≥1年者;（4）臨床資料完整者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)? （1）合并其他原發(fā)性腫瘤者;（2）嚴(yán)重貧血、感染或合并嚴(yán)重凝血功能障礙及心血管疾病者;（3）妊娠期或哺乳期婦女。

1.3 方法

1.3.1 資料收集? 統(tǒng)計(jì)患者就診時(shí)間、性別、年齡、術(shù)前血清甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）水平、HBsAg、病理類型及TNM分期、腫瘤直徑、病灶是否單發(fā)、是否肝硬化、腫瘤是否有包膜覆蓋、是否發(fā)生血管侵犯等基本資料。統(tǒng)計(jì)患者術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)或死亡情況。復(fù)發(fā)診斷：經(jīng)穿刺活檢證實(shí)術(shù)后復(fù)發(fā)情況。

1.3.2 Tim-3、Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)? 應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝癌組織及癌旁組織中Tim-3、Galectin-9表達(dá)情況。A切片：取肝癌組織及癌旁組織常規(guī)制作石蠟切片，切片機(jī)制作4 μm連續(xù)切片;B脫蠟及水化：切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，依次放入二甲苯Ⅰ 5 min、二甲苯Ⅱ 5 min、二甲苯Ⅲ 5 min，并利用不同濃度梯度酒精（100%→95%→85%→70%→50%）水化;C抗原熱修復(fù)：將預(yù)處理的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液放置于壓力鍋中，加熱至沸騰后將切片放入壓力鍋中，當(dāng)壓力閥噴氣后繼續(xù)加熱2 min停止加熱，自然冷卻，取出切片用自來(lái)水沖洗，并將其浸泡于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）緩沖液中;D染色前處理：用免疫組化專用筆在組織周圍畫圈標(biāo)注，再用PBS洗滌3次，每次5 min，玻片自然晾干，加入3%的過(guò)氧化氫孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min;E滴加抗原：每張切片分別加入50 μL一抗（鼠抗人Tim-3、Galectin-9單抗，Thermo公司），盡可能覆蓋組織，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次每次5 min，然后加入二抗（山羊抗鼠Tim-3、Galectin-9 免疫球蛋白G，Thermo公司），室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min;F顯色：辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒（R&D公司）顯色，光鏡下觀察控制反應(yīng)時(shí)間，顯色滿意后自來(lái)水沖洗，中性樹(shù)膠封片;G光鏡下觀察：在200倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的視野，以細(xì)胞呈現(xiàn)黃色或棕黃色判定為陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，并進(jìn)行蛋白表達(dá)程度判定[7]：陽(yáng)性細(xì)胞率<10%記為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞率≥10%記為陽(yáng)性。

1.4觀察指標(biāo)

①對(duì)比Tim-3、Galectin-9不同部位表達(dá)率;②Tim-3、Galectin-9表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系;③復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者Tim-3、Galectin-9表達(dá)差異;④死亡與存活患者Tim-3、Galectin-9表達(dá)差異。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，理論頻數(shù)≥0且≤5時(shí)組間計(jì)數(shù)資料進(jìn)行校正檢驗(yàn)，理論頻數(shù)>5組間計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn);采用秩和檢驗(yàn)分析等級(jí)計(jì)數(shù)資料。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tim-3、Galectin-9不同部位表達(dá)率比較

肝癌組織中Tim-3陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織（P<0.05），肝癌組織中Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織（P<0.05）。見(jiàn)表1、封三圖8。

2.2 Tim-3、Galectin-9表達(dá)與病理參數(shù)的關(guān)系

Tim-3陽(yáng)性組與陰性組性別、年齡、肝硬化、AFP水平、HBsAg、病理分型、TNM分期患者構(gòu)成比比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Tim-3陽(yáng)性組腫瘤直徑≥5 cm、多發(fā)病灶、血管侵犯、無(wú)腫瘤包膜患者構(gòu)成比顯著高于陰性組（P<0.05）;Galectin-9陽(yáng)性組與陰性組性別、年齡、肝硬化、AFP水平、HBsAg、TNM分期、病理分型患者構(gòu)成比比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），Galectin-9陽(yáng)性組腫瘤直徑≥5 cm、多發(fā)病灶、血管侵犯、無(wú)腫瘤包膜患者構(gòu)成比顯著低于陰性組（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)患者Tim-3、Galectin-9表達(dá)差異

術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)患者中Tim-3陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于未復(fù)發(fā)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;復(fù)發(fā)患者中Galectin-9表達(dá)率明顯低于未復(fù)發(fā)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 死亡與存活患者Tim-3、Galectin-9表達(dá)差異

術(shù)后1年內(nèi)死亡患者中Tim-3陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于存活患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;死亡患者中Galectin-9表達(dá)率明顯低于存活患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表4。

3討論

PLC是一種高發(fā)惡性腫瘤，主要包括肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌及混合性癌等多種病理類型，肝炎病毒感染、家族疾病史、嗜酒及黃曲霉毒素長(zhǎng)期暴露等均是導(dǎo)致PLC發(fā)病的危險(xiǎn)因素[8-9]。隨著醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，癌癥的治療取得了較大進(jìn)步，但PLC患者的預(yù)后仍然較差，中位生存期不足1.5年[10]。因此，亟需尋找早期預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，以及時(shí)制定并實(shí)施有效治療措施，對(duì)改善PLC患者預(yù)后、延長(zhǎng)生存期有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中Tim-3陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織（P<0.05），肝癌組織中Galectin-9陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織（P<0.05），提示肝癌組織中Tim-3異常高表達(dá)、Galectin-9異常低表達(dá)。Tim-3是一種優(yōu)勢(shì)表達(dá)于CD4+、CD8+細(xì)胞表面的一種抑制性分子，可調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞免疫功能，且抑制干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的生成[11]。高表達(dá)的Tim-3可影響腫瘤微環(huán)境中的IFN-γ生成及Th1細(xì)胞功能，下調(diào)免疫系統(tǒng)功能，利于肝癌細(xì)胞的免疫逃避[12]。Galectin-9是β-半乳糖苷結(jié)合蛋白家族重要成員之一，在T細(xì)胞及胸腺細(xì)胞的發(fā)育、腫瘤細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用[13]。Galectin-9是Tim-3的特異性配體，二者結(jié)合可介導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，多種腫瘤組織如黑色素瘤、乳腺癌組織中，Galectin-9呈陰性表達(dá)，而在正常組織中高表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。由此，PLC患者癌組織中Tim-3異常高表達(dá)與Galectin-9的異常低表達(dá)，利于肝癌細(xì)胞增殖。

此外，本研究中，Tim-3陽(yáng)性組腫瘤直徑≥5 cm、多發(fā)病灶、血管侵犯、無(wú)腫瘤包膜患者構(gòu)成比顯著高于陰性組（P<0.05），Galectin-9陽(yáng)性組上述指標(biāo)顯著低于陰性組（P<0.05）;術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)和死亡患者中Tim-3陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于未復(fù)發(fā)和存活患者（P<0.05）;復(fù)發(fā)和死亡患者中Galectin-9表達(dá)率顯著低于未復(fù)發(fā)和存活患者（P<0.05），提示Tim-3、Galectin-9與PLC多種病理學(xué)特征有關(guān)，且復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)、死亡與存活患者中Tim-3、Galectin-9蛋白表達(dá)存在差異。癌組織中浸潤(rùn)的大部分CD8+ T淋巴細(xì)胞表面Tim-3大量表達(dá)，但該表型中的T細(xì)胞增殖及分泌炎癥細(xì)胞因子的功能基本喪失，且與腫瘤惡性程度密切相關(guān)[17]。Tim-3參與腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移與血管形成、腫瘤微環(huán)境缺氧、免疫逃逸等多種調(diào)節(jié)機(jī)制，可能是導(dǎo)致不同臨床表現(xiàn)患者Tim-3表達(dá)差異的原因[18]。既往研究證實(shí)，多種腫瘤組織中Galectin-9呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，并與患者預(yù)后有關(guān)，如在乳腺癌組織中，伴遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的Galectin-9陽(yáng)性患者無(wú)復(fù)發(fā)生存率為95%，顯著高于陰性表達(dá)者的44%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性患者生存率達(dá)90%，顯著高于陰性表達(dá)者的25%[19-20]。癌組織中Galectin-9高表達(dá)者有效抑制腫瘤進(jìn)展，可能是高表達(dá)Galectin-9與高表達(dá)Tim-3的Th1細(xì)胞結(jié)合，重新調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡狀態(tài)，利于腫瘤微環(huán)境的免疫監(jiān)視作用，改善PLC患者的預(yù)后[21]。因此，Tim-3、Galectin-9表達(dá)情況與PLC患者的多種病理特征有關(guān)，并且可影響患者預(yù)后。

綜上所述，Tim-3的高表達(dá)、Galectin-9低表達(dá)與PLC多種病理學(xué)特征有關(guān)，且復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)、死亡與存活患者中Tim-3、Galectin-9蛋白表達(dá)存在差異，提示臨床中可通過(guò)檢測(cè)此二種蛋白在肝癌組織中的表達(dá)評(píng)估預(yù)后，并可通過(guò)積極控制Tim-3、Galectin-9的表達(dá)，干擾PLC進(jìn)展，進(jìn)而改善預(yù)后。

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（收稿日期：2018-07-13）