外周血單個核細胞NF-rB活性與急性缺血性腦卒中的相關性研究

黃苗　師宏　白艷艷　康林娥

[摘要]目的探討外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）中細胞核因子rcB（nuclearfactorkappaB，NF-kB）活性預測急性缺血性腦卒中（acuteischemicstroke，AIS）患者神經功能預后的臨床價值。方法連續(xù)性納入在我院治療的74例AIS患者，通過流式細胞術分析AIS患者的PBMC中的NF-rcB活性，并與健康人群進行對照比較。以90天改良Rankin量表（mRS）評分大于2分為主要評價指標，評估NF-rB活性對神經功能預后不良的預測價值。結果AIS患者的PBMC中平均NF-kB活性顯著高于健康對照人群[（28.32+8.70）%：（13.19+4.51）%，P<0.01]。預后不良組患者的PBMC中NF-rB活性顯著高于預后良好組患者[（32.60+4.82）%：（23.42+6.51）%，P<0.01]。與預后良好組相比，預后不良組患者的年齡更高[（62.12±12.83）歲：（53.32±13.41）歲，P=0.02]、合并心房顫動更多（35.39%：12.28%，P=0.03）、入院時NIHSS評分更高[（15.78±3.43）分：（11.23+4.51）分，P<0.01]。ROC曲線顯示PBMC中NF-kB活性對神經功能預后不良的預測閾值為28.20%，靈敏度為87.31%、特異度為72.12%。多因素Logistics回歸分析顯示NF-cB活性>28.20%（OR=2.44，95%CI：1.78～3.92，P<0.01）和入院時美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表（NIHSS）評分>14分（OR=1.65，95%CI：1.14～2.58，P=0.02）是影響AIS患者神經功能預后不良的獨立危險因素。結論AIS患者PBMC中NF-rB活性顯著升高，并且升高的NF-rB活性與AIS患者的神經功能預后不良獨立相關。

[關鍵詞]急性缺血性腦卒中;外周血單個核細胞;細胞核因子cB

中圖分類號：R743.33

文獻標識碼：A

文章編號：1009-816X（2019）06-0513-04

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2019.06.008

Correlation between Nuclear Factor Kappa B （ NF-KB ） Activity in Peripheral Blood ， Mononuclear Cell and Acute Ischemic Stroke. HUANG Miao， KANG Lin-E， BAI Yan-yan. Department of Neurology， Yulin First Hospital ， Shaanxi 719000， China

[ Abstract ] Objective To investigate the clinical value of nuclear factor kappa B （ NF-KB ） activity in peripheral blood mononuclear with healthy controls. The 90-Day modified Rankin scale（ mRS ） score > 2 was set as the main evaluation indicator， and evaluated was significantly higher than that of healthy controls（ 28.32 t 8.70% vs 13.19+4.51%， P <0.01 ）. The NF-KB activity in PBMC of patients with poor prognosis was significantly higher than that of patients with well prognosis（ 32.60+4.82% vs 23.4216.51 % ， P<0.01 ）. Compared with the well prognosis group， the patients with poor prognosis were older （ 62.12t 12.83 years vs 53.32 t 13.41 years， P= 0.02）， with more atrial fibrillation （ 35.39% vs 12.28%， P =0.03 ）， and higher NIHSS score at admission （ 15.7813.43 points vs 11.2314.51， P<0.01 ）. The ROC curve showed that the predictive threshold of NF-KB activity in PBMC for poor neurological prognosis was 28 .20%， with the sensitivity of 87.31 % and specificity of 72. 12% . Multivariate logistic regres-sion analysis showed NF-KB activity > 28 .20% （ OR=2.44， 95% CI： 1.78～3.92， P<0.01 ） and NIHSS score at admission > 14.00（ OR=1.65， 95% CI： 1.14～ 2.58， P = 0.02 ） were independent risk factors for affecting the poor neurological function ofcell （ PBMC ） in predicting neurological prognosis in patients with acute ischemic stroke （ AIS ）. Methods 74 patients with AIS treated in our hospital were continuously enrolled. Flow cytometry was used to analyze NF-KB activity in PBMC of AIS patients and compared the predictive value of NF-KB activity for poor neurological prognosis. Results The mean NF-KB activity in PBMC of patients with AIS in patients with AIS. Conclusions NF-KB activity was significantly elevated in PBMC of patients with AIS， and elevated NF-KB activity was independently associated with poor neurological prognosis in patients with AIS.

[Key words ] Acute ischemic stroke; Peripheral blood mononuclear cell; Nuclear factor kappa B

急性缺血性腦卒中（acuteischemicstroke，AIS）是因大腦血容量突然減少而導致腦組織迅速死亡，嚴重影響患者健康和神經功能的疾病[1].近年來的研究

提出免疫和炎癥反應在腦卒中的疾病進展和所有階段中起到關鍵性作用，包括腦卒中的急性發(fā)展和腦卒中后的長期恢復[2]。而炎癥因子成為目前AIS研究的熱點。細胞核因子reB（nuclearfactorkappaB，NF-kB）是一種能夠促進多種炎癥因子表達的轉錄因子，處于炎性反應的核心位置，具有抗炎和促炎的雙重作用[3]。但外周血中NF-kB的活性改變與AIS患者疾病嚴重程度及預后的關系目前少見報道。因此本文主要探討AIS患者外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）中NF-kB的活性改變及其對預后的影響。

1資料和方法

1.1一般資料：連續(xù)性納入2017年1月至2017年12月間在我院治療的AIS患者74例，其中男38例，女36例，年齡43～83歲，平均（54.21±12.32）歲。納入標準：（1）符合<中國急性缺血性腦卒中診治指南2014版>診斷標準[4]，經頭顱CT或MRI檢查確診;（2）神經功能障礙，即入院時美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表（nationalinstituteofhealthstrokescale，NIHSS）評分>2分;（3）首次發(fā)病;（4）腦卒中發(fā)病8h以內;（5）近3個月內未使用激素、免疫抑制劑或細胞毒性藥物。排除標準：（1）外傷性腦出血、動脈瘤或動脈硬化、蛛網膜下腔出血等;（2）合并自身免疫性疾病或急慢性感染狀態(tài);（3）合并重要臟器功能障礙或衰竭。本研究同期招募了40例年齡匹配、且無腦卒中病史、無自身免疫性疾病或急慢性感染狀態(tài)的健康體檢人群作為對照組。本研究經本院倫理委員會審核通過，并經受試者及其家屬簽署知情同意書。

1.2方法：

1.2.1PBMC中NF-kB活性檢測：AIS患者在入院后即刻抽取肘靜脈血、對照組在清晨空腹抽取靜脈血，采用流式細胞儀檢測NF-kB活性。步驟如下：（1）制備PMBC懸浮液：取2mL經EDTA抗凝處理的血液樣本，加入2mL溶血素，充分混勻后室溫靜置25～30min，2000r/min離心5min，共2次，棄上清，加入1mLPBS緩沖液，搖勻后加入150μLA液，靜置10min后加人150pLB液，靜置10min后重復上述步驟一遍。（2）染色：向上述制備好的PBMC懸液中加入0.2mLPBS緩沖液，調整細胞數(shù)目為1.0x10%/mL，吸取約10μL細胞懸液置于載玻片中，Wright-Giemsa染色1次，顯微鏡下觀察PBMC懸液是否制備成功。（3）流式染色：直接向成功制備的PBMC懸液中加入0.5pL的NF-kB抗體（NF-kBp65McAb，美國SantaCruz公司），室溫靜置1h后加入40μLFTTC標記的IgG（1：100稀釋），室溫下靜置30min，再加入20μLPI染料，暗室內靜置5min。（4）流式檢測：采用流式細胞儀（美國BectonEDickinson公司，F(xiàn)ACS400型）檢測NF-kB活性。

1.2.2觀察指標：所有患者在入院時、入院后24h和出院時進行NIHSS評分，并在發(fā)病后90d通過改良Rankin量表（mRS）評估AIS患者的神經功能情況。以90d時的mRS評分為主要觀察指標，其中mRS評分≤2分為神經功能恢復良好，而mRS為3～6分認為神經功能預后不良。

1.3統(tǒng)計學處理：采用SPSS23.0版軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，組間比較采用卡方（x2）檢驗。采用受試者工作特征曲線（receiveroperat-ingcharacteristic，ROC）和曲線下面積（AUC）分析NF-kB活性對AIS神經功能不良預后的預測價值及預測閾值;通過單因素及多因素Logistic回歸分析確定影響AIS患者神經功能預后的獨立危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1AIS患者的PBMC中NF-kB活性：AIS患者的PBMC中平均NF-kB活性為（28.32+8.70）%，而對照組的平均NF-kB活性為（13.19±4.51）%，差異存在統(tǒng)計學意義（t=10.25，P<0.01），見圖1。

2.2AIS患者神經功能預后分組比較：根據90d時mRS評分將74例患者分為預后良好組（57例）和預后不良組（17例）。與預后良好組比較，預后不良組患者的年齡更高、合并心房顫動更多、入院時NIHSS評分更高，NF-kB活性顯著更高差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.3NF-xB活性對神經功能預后的預測價值分析：PBMC中NF-xB活性對神經功能預后不良的預測價值AUC=0.87（P<0.01），閾值為28.20%，靈敏度為87.31%、特異度為72.12%。入院時NIHSS評分對神經功能預后不良的預測價值AUC=0.76（P<0.01），閾值為14.00，靈敏度為69.41%、特異度為77.52%。見圖2。

2.4影響AIS患者神經功能預后不良的獨立危險因素分析：以年齡、心房顫動、入院時NIHSS評分、NF-kB活性為自變量，神經功能預后不良為因變量進行多因素Logistics回歸分析。結果顯示NF-kB活性>28.20%和入院時NIHSS評分>14分是影響AIS患者神經功能預后不良的獨立危險因素，見表2。

3討論

AIS是神經系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，具有發(fā)病率高、死亡率高和致殘率高的特點，是人類疾病的三大死亡原因之一[5]。AIS的病理生理機制十分復雜，傳統(tǒng)的觀點認為腦血流阻斷導致的腦組織缺血、缺氧損害，隨后誘發(fā)的神經細胞壞死和凋亡是其主要的病理生理機制[6]。但近年來隨著相關研究的深人，逐漸發(fā)現(xiàn)腦缺血后導致的炎癥瀑布反應在腦損傷中的重要地位。已有研究證實，腦缺血后存在明顯的炎癥細胞聚集增加、促炎因子表達上調，細胞間粘附分子表達增加等炎癥反應，提示炎癥反應是腦組織缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)[7]。

NF-kB是一種具有多向性調節(jié)作用的核轉錄因子，由p50和p60兩個蛋白亞基組成。NF-kB是參與細胞內信號轉導的重要轉錄因子，其生物學功能是調控基因、特別是免疫炎癥相關基因的轉錄[8]。一般情況下，NF-xB與抑制因子IkB結合，以非活性形式存在于胞漿中，當在外界信號作用下，IkB發(fā)生磷酸化進而降解，與NF-kB解離并移人核內，激活相應基因的轉錄而發(fā)揮作用，從而參與機體的免疫和炎癥反應[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，AIS患者PBMC中NF-kB的活性明顯升高，表明AIS患者體內存在NF-kB的表達和激活異常，這種異常可能通過調控許多基因特別是免疫炎癥相關基因的轉錄表達，從而參與機體的免疫和炎癥反應，參與了AIS發(fā)展。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)神經功能預后不良的AIS患者的NF-kB活性顯著高于神經功能預后良好的AIS患者，表明NF-kB在AIS的疾病進展中起到一定的作用。進一步通過ROC曲線發(fā)現(xiàn)PBMC中NF-kB活性超過28.20%是預測AIS患者神經功能預后不良的最佳閾值，靈敏度達87.31%、特異度達72.12%。并且通過多因素Logistics回歸分析證實了PBMC中NF-kB活性超過28.20%是影響AIS患者神經功能預后不良的獨立危險因素，提示PBMC中NF-kB活性能夠有效評估AIS患者的神經功能改善及預后情況。

由于NF-kB的活化炎癥反應是復雜細胞因子網絡的中心環(huán)節(jié)[10]。而本研究發(fā)現(xiàn)AIS患者的外周血PBMC中NF-kB活性顯著高于健康人群，同時NF-kB升高預示了AIS患者的神經功能預后不良。因此遏制NF-kB的活化，從而減少多種炎癥介質的產生，為AIS患者的治療和預后管理提供了新的思路，為臨床防治并發(fā)癥提供新的證據。

綜上所述，本文證實AIS患者處于NF-kB活化的狀態(tài)，并且NF-kB活性是影響AIS患者神經功能預后不良的獨立危險因素，為臨床診斷和隨訪AIS及其神經功能預后情況提供了新的檢測指標。但由于本研究僅為單中心小樣本的，因此仍需要進一步通過多中心、大樣本的前瞻性研究證實本研究結論。

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（收稿日期：2019-3-26）