探討一種新型Wnt替代蛋白激活腦血管Wnt信號通路對血腦屏障的保護作用

曾 毅， 榮先芳， 方 程， 尹美芳， 梁 迅， 暢君雷

腦卒中是由于腦血管突然堵塞或者破裂導致局部腦組織血液供應障礙所致的一種急性腦疾病，其中超過75%為缺血性腦卒中[1]。腦血管除了輸送血液、供給養分外，還具有特殊的“血腦屏障”(Blood-Brain Barrier，BBB)功能。血腦屏障高度選擇性的輸送血液中的有益成分進入腦組織，而限制血液中的有害物質通過，從而保持腦組織微環境的穩定和中樞神經系統的正常功能[2]。研究表明，在缺血性腦卒中發生時腦血管受到缺血再灌注損傷，血腦屏障遭到破壞，血液中的有害成分，比如炎性因子和免疫細胞，進入腦組織中加劇腦組織損傷[3]。Wnt是一類分泌性糖蛋白，通過與其受體FZD和LRP5/6結合，誘導依賴于β-catenin的信號通路(又叫經典Wnt信號通路)激活，進而調節多個生物過程，包括細胞生長、分化以及干細胞自我更新，調控細胞命運，促進多種組織的生長和修復[4，5]。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發育中對腦血管發育和血腦屏障形成起核心的調控作用，主要表現在以下三個方面：(1)內皮細胞Wnt/β-catenin信號通路功能的缺失特異性影響腦血管發育和血腦屏障功能，卻并不影響其他器官和組織的血管發育和功能[6，7]；(2)在小鼠神經組織中敲除Wnt7a/7b[6，7]或者在內皮細胞中敲除Wnt的受體FZD4[8]、LRP5/6[9]、受體激活劑Gpr124[10～12]或者Ctnnb1(β-catenin)[13]，均可導致腦血管發育和血腦屏障功能異常；(3)在體外培養的內皮細胞中激活Wnt/β-catenin信號通路可以顯著上調血腦屏障功能相關基因的表達[14]。我們前期研究發現，腦血管內皮細胞中Wnt/β-catenin信號通路活性升高可顯著保護缺血性腦卒中后小鼠的血腦屏障功能，并進而減少腦梗死體積、提高小鼠生存率[15]。

天然的Wnt蛋白由于側鏈的棕櫚油酸酯修飾，導致其水溶性差，難以表達純化，極大地限制了Wnt蛋白的生物和醫學應用[4]。斯坦福大學的Janda等學者研發出一種新型Wnt替代蛋白(Wnt surrogate，Wnt-S)，由FZD受體的中和抗體Vantictumab的單鏈可變區(scFv，single-chain variable fragment)和LRP5/6結合蛋白DKK1的C端區域連接而成，形成一個新的融合蛋白scFv-DKK1c[16]。Vantictumab的scFv部分能與FZD1，2，5，7，8高親和力結合，而DKK1的C端區域能與LRP5/6結合，因而這種人工合成的Wnt-S蛋白可同時與FZD和LRP5/6結合并激活下游的Wnt/β-catenin信號通路，且易溶于水、容易表達純化，在細胞實驗和小鼠體內都顯示出良好的生物功能。我們前期合成出Wnt-S的基因片段，通過分子克隆和蛋白表達純化技術得到Wnt-S蛋白，探尋Wnt-S蛋白對人腦血管內皮細胞Wnt/β-catenin信號通路的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞和主要試劑 HEK293細胞由北京大學深圳研究院贈送，HEK293F和hCMEC/D3細胞購自美國ATCC。限制性內切酶EcoRI和XbaI購自NEB公司。感受態細胞和T4 DNA連接酶購自TaKaRa。LB培養基粉末(Thermo Fisher)，西班牙瓊脂糖(BIOWEST)，無內毒素質粒大提試劑盒(TIANGEN)，PEI(Polysciences)，Ni SepharoseTM6 Fast Flow(GE Healthcare)，BCA蛋白定量試劑盒(Solarbio)，一抗稀釋液(日本東洋紡)，ECL發光液(MILLIPORE)，His-Tag (D3I1O) XP?Rabbit mAb，Anti-rabbit IgGAlexa Fluor594 Conjugate和Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody(CST)，CD31抗體和VE-cadherin抗體，GLUT1抗體和MFSD2A抗體(Abcam)。DMEM高糖培養基和雙抗(HyCloneTM)，澳洲胎牛血清和羊血清(Gibco)，Endothelial Cell Medium(ScienCell)，FreestyleTM293 Expression Medium(Invitrogen)。TRIzol Reagent(Life technologies)，Direct-zol RNA Miniprep(ZYMO RESEARCH)，反轉錄試劑盒和SYBR qPCR Mix(諾唯贊)。4%組織細胞固定液，Triton X-100，封片劑(含DAPI)(Solarbio)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分子克隆 將金唯智公司合成的Wnt-S in pUC57-Kan(Wnt-S基因片段兩端有EcoRI和XbaI兩個酶切位點)，用EcoRI和XbaI切下Wnt-S片段(具體方法參照NEB公司這兩種酶的使用說明)，同樣的方法切割pcDNA3.1 (+)載體，分別跑核酸凝膠電泳，紫外下切膠回收純化目的基因片段Wnt-S(1189 bp)和pcDNA3.1 (+)載體(6.4 kb)，用T4 DNA連接酶連接目的片段和載體，再將連接好的質粒與感受態細胞做轉化，均勻涂布在含氨芐青霉素的平板上，待長出菌落，挑取單克隆于2～5 ml 含氨芐抗性的LB液體培養基中，37 ℃，300RPM搖床上培養8 h，小提質粒，EcoRI和XbaI雙酶切該質粒，核酸凝膠電泳驗證，一條帶大小在6.4 kb，另一條帶大小在1.2 kb，再進行大提質粒。

1.2.2 細胞轉染 轉染前對HEK293F細胞進行計數，用20 ml PBS稀釋質粒(400 μg)，小心混勻，記為A液，用20 ml PBS稀釋PEI(800 μl)，小心混勻，記為B液(質粒：PEI=1∶2，W∶V)，室溫靜置5 min。將B液緩慢加入到A液中，用渦旋振蕩器邊加邊振蕩，室溫靜置20 min。將DNA-PEI混合液緩慢加入到360 ml FreestyleTM293 Expression培養基中，輕輕混勻，使細胞密度在0.8×106～1.2×106cells/ml，置于37 ℃，8% CO2，125 r/min細胞培養箱的水平搖床中培養。每天取少量培養基，檢測細胞活度，待細胞活度接近70%時，停止培養，1000 r/min離心收集上清。

1.2.3 Wnt-S蛋白表達純化 組裝好恒流泵，將進液管插入平衡液中，出液管插入廢液槽，往填料柱中加入0.5 ml Ni SepharoseTM6 Fast Flow，開啟恒流泵，調節速率，使平衡液勻速流出。30 min后，將進液管插入含Wnt-S蛋白的上清中，出液管插入干凈的收集瓶中，使液體勻速流過柱子，并且避免將填料沖起。此過程在4 ℃環境下進行，待上清全部流過柱子，再按上述同樣的操作，將收集瓶中的液體再過一次柱子。用20 mmol/ml，40 mmol/ml，60 mmol/ml，80 mmol/ml，120 mmol/ml，160 mmol/ml咪唑(六種濃度的咪唑體積均為10 ml)依次洗脫柱子，并分別收集洗脫液，再將這些洗脫液分別加入10 kDa離心過濾器中，在4 ℃，4000 r/min，15 min條件下離心，濃縮后的液體即為Wnt-S蛋白溶液。

1.2.4 Western blot檢測Wnt-S蛋白 BCA蛋白定量試劑盒檢測樣品的濃度，計算上樣量。取一定量蛋白與5x蛋白上樣緩沖液混勻，置于100 ℃金屬浴中處理5～10 min，配制10%分離膠和5%濃縮膠，進行電泳。電泳條件：80 V，30 min，120 V直到溴酚藍進入濃縮膠底部，停止電泳。轉膜條件：300 mA，90 min。5%脫脂奶粉溶于TBST封閉1 h，用抗體稀釋液稀釋相應一抗，PVDF膜被一抗覆蓋，置于4 ℃，搖床上過夜。TBST洗膜3次，5 min/次，孵二抗，搖床上常溫1 h，TBST洗膜3次，5 min/次，顯影。

1.2.5 免疫熒光染色鑒定hCMEC/D3細胞 在Chamber Slide的小室中接種1×105個細胞，置于培養箱中過夜。吸掉小室中的培養基，加入適量4%組織細胞固定液，于4 ℃，15 min。吸掉固定液，預冷PBS洗3次，5 min/次。預冷0.2%Triton X-100處理8～10 min。吸掉0.2%Triton X-100，預冷PBS洗3次，5 min/次。5%羊血清(用PBS稀釋)，37 ℃，封閉1 h。孵相應一抗(用1%羊血清稀釋)，4 ℃過夜。吸掉一抗，預冷PBS洗3次，5 min/次。避光孵相應二抗(用1%羊血清稀釋)，4 ℃，1 h。吸掉二抗，預冷PBS洗3次，5 min/次(避光)。滴封片劑(封片劑：PBS=1∶1稀釋)封片，指甲油固定。固定后，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測FZD1-10、LRP5/6和AXIN2的表達 用Trizol裂解細胞，RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA，Nano Drop 2000c檢測RNA的濃度，逆轉錄得到cDNA(具體方法參照諾唯贊的說明書)，然后進行qPCR(具體方法參照諾唯贊的說明書)。

2 結 果

2.1 Wnt-S蛋白表達載體的構建 核酸電泳的結果顯示Wnt-S in pcDNA3.1 (+)質粒成功構建(見圖1)。

a：Lane1為Marker；Lane2，3中3 kb左右的條帶為pUC57載體，1.2 kb左右的條帶為Wnt-S；Lane5和6中6.4 kb左右的條帶為pcDNA3.1載體，還有一個切割下的小片段小于250 bp，所以在圖上沒有顯示。B：Lane1為Marker；Lane3、4、5中6.4 kb左右的條帶為pcDNA3.1載體，1.2 kb左右的條帶為Wnt-S

圖1 核酸電泳結果

2.2 Wnt-S蛋白的細胞轉染和表達 Western blot結果表明在轉染后的細胞上清中檢測到了Wnt-S蛋白，其表達純化的最佳條件為轉染后5 d收集上清，120 mmol/ml咪唑洗脫(見圖2)。

a：取轉染0～6 d的上清，檢測Wnt-S。B：梯度濃度20～160(mmol/ml)咪唑洗脫Wnt-S。一抗Anti-His，Rabbit(1∶1000)，二抗Anti-Rabbit(1∶10000)

圖2 Western blot結果

2.3 hCMEC/D3內皮細胞的鑒定 免疫熒光染色結果顯示，hCMEC/D3細胞高表達內皮細胞Marker CD31、VE-cadherin和血腦屏障Marker GLUT1、MFSD2A(見圖3)。

2.4 Wnt-S蛋白對hCMEC/D3細胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活作用 首先，實時熒光定量PCR的結果顯示HEK293和hCMEC/D3細胞中FZD1-10和LRP5/6的表達情況(見圖4A、圖4B)。其次，實時熒光定量PCR的結果顯示加Wnt-S蛋白和Wnt3a蛋白處理后，HEK293和hCMEC/D3細胞中AXIN2表達顯著性上調，Wnt/β-catenin信號通路被顯著激活(見圖4C、圖4D)。

一抗CD31(1∶50)，一抗VE-cadherin(1∶100)；一抗GLUT1(1∶500)，MFSD2A(1∶500)。二抗Anti-Rabbit(1∶10000)。EC：內皮細胞；BBB：血腦屏障

圖3 免疫熒光染色結果

a：HEK293細胞中Wnt受體FZD1-10和LRP5/6表達情況。B：hCMEC/D3細胞中Wnt受體FZD1-10，LRP5/6和細胞Marker(CD31和MFSD2A)表達情況。C：加藥處理24 h后，HEK293細胞中AXIN2的表達情況。D：加藥處理24 h后，hCMEC/D3細胞中AXIN2的表達情況。(ns：無統計學意義；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

圖4 實時熒光定量PCR的結果

3 討 論

目前已經發現了19種不同的哺乳類Wnt蛋白，這些蛋白與10種FZD受體雜亂的結合，形成了不同的生物學功能[4，5]。Wnt翻譯后通過蛋白質棕櫚化作用形成了棕櫚油酸酯修飾，這個修飾對于Wnt蛋白的分泌和其與FZD相互作用的關鍵位點形成至關重要[17～19]。然而，棕櫚油酸酯化使天然Wnt蛋白變得非常疏水，這嚴重阻礙了Wnt重組蛋白的制備和應用，也不利于進一步了解Wnt信號通路的分子機制、FZDs亞型的功能意義、以及將Wnt蛋白作為一種新的治療藥物[16]。本文中，我們發現人工合成的Wnt替代蛋白具有與天然Wnt3a蛋白類似的生物學功能，都能激活hCMEC/D3細胞中Wnt/β-catenin信號通路。Wnt-S蛋白的優勢在于能與多個FZD受體(FZD1，2，5，7，8)結合，且水溶性高、容易表達純化和大規模制備，可能具有更廣闊的生物和醫學應用前景。而鑒于Wnt/β-catenin信號通路對腦血管血腦屏障功能維持起重要的調控作用，這提示我們在腦卒中發生后，Wnt-S可能作為一種新的治療手段去保護或修復腦缺血再灌注后受損的血腦屏障，改善患者預后。