Caveolin-1和miR-199a-5p在缺血性腦卒中患者外周血及模型大鼠腦組織、脾臟中的表達及其意義

李鵬飛 李帆 高峰 張春兵,

(南京中醫藥大學 1附屬醫院檢驗科，江蘇 南京 210029；2基礎醫學院)

缺血性腦卒中(IS)的傳統危險因素為高血壓、年齡、糖尿病、房顫、高脂血癥等，主要病理生理機制包括能量紊亂、氧化應激、鈣離子超載、神經細胞興奮性損害及炎癥等〔1，2〕。其中炎癥越來越成為人們關注的熱點。

膜微囊蛋白(Cav)-1 是一種細胞表面的穴樣內陷中的主要膜內在蛋白，可表達在中樞神經系統多種細胞上，如小膠質細胞、內皮細胞、周細胞及星形膠質細胞〔3〕。Cav-1與細胞外基質相互作用調控內皮緊密連接蛋白，維護血腦屏障的完整性；Cav-1也參與調控免疫應答〔4〕，在人和小鼠巨噬細胞抗炎過程中發揮重要作用〔5〕。Cav-1可在腦卒中免疫應答過程中扮演抗炎和促炎不同角色〔6～9〕，其在IS患者外周和神經組織中的表達和功能值得進一步研究。

微小核糖核酸(miRNAs)是一種小的非編碼RNAs,通過靶向調控mRNAs從而發揮轉錄后調控功能。miRNAs可參與多種生理學進程，其失調可導致多種病理反應的發生。尤為重要的是，miRNAs可調控多種固有免疫防御和免疫應答。本課題組前期發現，腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織中miR-199a-5p表達升高〔10〕。有研究表明，miR-199a-5p可調控單核巨噬細胞分化，減輕巨噬細胞炎癥反應〔11,12〕。但其與Cav-1的關系如何，其在免疫反應中扮演的角色仍不清楚。本文擬研究Cav-1與miR-199a-5p在急性初發IS患者外周和神經免疫應答中的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 Ficoll人淋巴細胞分離液(天津灝洋公司)；Trizol(上海Invitrogen公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)反轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司)；miR-199a-5p和Cav-1熒光定量檢測試劑盒(瑞士Roche公司)；Biophotometer plus核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf公司)；Veriti 96 Well Thermal Cycler熱循環儀(美國ABI公司)；ABI 7500熒光定量擴增儀(美國ABI公司)；AU5800全自動生化分析儀(美國Beckman公司)；Bio-Rad model 680酶標儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2研究對象 收集2017年5～10月在江蘇省中醫院腦病中心住院的初發IS患者24例(IS組)，診斷滿足1996年全國第四屆腦血管病學術會議修訂的急性腦卒中診斷標準，并同時經影像學檢查證實。納入標準：首發IS(發病24 h內)，經臨床醫生診斷及影像學檢查確診。排除標準：①出血性腦卒中；②IS復發；③明顯感染；④血液學疾病；⑤重度腎功能不全；⑥重度肝功能不全；⑦惡性腫瘤；⑧近一年有外科手術病史；⑨曾口服免疫抑制藥物。同時收集22例年齡、性別匹配的符合上述排除標準的健康正常人作為對照組。操作均嚴格遵守醫學倫理道德，經患者及家屬同意，并經南京中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.3樣本采集 在腦卒中癥狀發生24 h內采集乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝外周血2 ml。同時收集空腹血檢測各項生化指標。另收集體檢健康的正常人外周血作為對照。

1.4外周血單個核細胞(PBMC)分離 向15 ml離心管中倒入2 ml淋巴細胞分離液，接著緩慢倒入采集的研究對象的EDTA-K2抗凝全血，2 000 r/min離心20 min；吸取中間薄紗層至2 ml離心管，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入Trizol 試劑，-80℃保存。

1.5生化指標檢測 采用AU5800全自動生化分析儀測定空腹血糖、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)含量。

1.6實驗動物及分組 選擇SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠〔體重(280±20)g〕，購自北京維通利華動物實驗有限公司〔許可證號：SCXK(京)2016-0011〕。飼養環境：(22±2)℃室溫、50%～60%濕度、通風良好、12 h/12 h晝夜節律。大鼠可自由攝食與飲水。術前大鼠禁食12 h。采用隨機數字表法分為假手術組和大腦中動脈梗死(MCAO)組，每組6只。

1.7MCAO模型構建 參照文獻〔10〕，用改良Zea Longa線栓法建立大鼠MCAO模型。采用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g體重) 腹腔注射麻醉大鼠，頸正中切開皮膚，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈。頸外動脈遠心端結扎，微型動脈夾夾住頸總動脈近心端及頸內動脈，在靠近頸總動脈分叉處用眼科剪在頸外動脈上剪一小口，將直徑0.23～0.26 mm的魚線沿小切口插入頸外動脈，剪斷頸外動脈遠心端，移去頸內動脈的動脈夾，經頸總動脈分叉處將魚線緩慢向頸內動脈入顱腦的方向推進(18±0.5)mm，微遇阻力時停止，使魚線頭端到達較細的大腦中動脈起始處。縛緊預先放置于穿刺小切口處的絲線，縫合，消毒，缺血2 h后拔出栓線。假手術組只分離暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸外動脈。

1.8神經功能缺陷評分 再灌注24 h后，采用Zea Longa評分標準〔10〕對大鼠進行神經功能評分。0分，正常，無神經學征象；1分，出現Honer征；2分，拎起大鼠尾巴時左前肢不能伸展；3分，一側肢體不完全癱瘓，大鼠向左側轉圈；4分，一側肢體完全癱瘓，大鼠向左側傾倒；5分，死亡。將其中評分≥2分且<5分的大鼠，納入實驗組，而將評分為1分或5分的大鼠剔除。隨后，麻醉、處死大鼠，分離收集腦皮質和脾臟組織標本。

1.9實時熒光定量PCR 人外周血PBMC及大鼠腦皮質和脾臟組織總RNA提取采用Trizol試劑。采用Biophotometer plus核酸蛋白測定儀在A260/280處檢測提取RNA的濃度和純度，選取結果1.8～2.0的樣本，按PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒說明書分別進行成熟miR-199a-5p及總RNA的逆轉錄。20 μl反轉錄體系：4 μl 5×RT緩沖液，2 μl dNTP，miR-199a-5p、U6 snRNA逆轉錄引物或0.5 μl Oligo dT，0.5 μl ReverTra Ace，0.5 μl RNase抑制劑，1 μg總RNA，焦磷酸二乙酯(DEPC)水至20 μl。反應程序：16℃ 10 min，42℃ 40 min，70℃ 15 min，4℃ 5 min和42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min。采用Veriti 96 Well Thermal Cycler熱循環儀進行反應。用miR-199a-5p和Cav-1熒光定量檢測試劑盒分別進行miR-199a-5p和Cav-1的擴增，采用ABI7500熒光定量擴增儀進行檢測。反應體系總體積20 μl：熒光定量探針法反應預混液(2×探針混合物)10 μl，模板cDNA 1 μl，20×miR-199a-5p或U6 snRNA或Cav-1或β-actin探針和擴增引物預混液1 μl，用ddH2O補齊剩余體積。PCR反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s；60℃ 1 min，進行40個循環。結果用SDS2.0軟件進行分析。以U6 snRNA和β-actin分別作為miR-199a-5p和Cav-1的內參。目的基因的相對表達量按2-ΔΔCt的公式計算得到。

1.10統計學方法 利用SPSS21.0軟件行t檢驗或非參數Mann-WhitneyU檢驗。

2 結 果

2.1IS組與對照組臨床特征及PBMC中miR-199a-5p和Cav-1表達水平比較 IS組和對照組性別、年齡、空腹血糖、TG、TC、HDL-C、LDL-C水平均無統計學差異(均P>0.05)。見表1。IS組PBMC中miR-199a-5p明顯升高〔對照組(1.15±0.13)vs IS組(2.36±0.29)；t=3.671，P<0.001〕，而Cav-1顯著降低〔對照組(1.23±0.12)vs IS組(0.86±0.09)，t=2.58，P<0.05〕。

表1 兩組臨床特征比較

2.2假手術組和MCAO組腦皮質miR-199a-5p和Cav-1表達水平比較 與假手術組相比，MCAO組腦皮質中miR-199a-5p顯著升高〔MCAO組(2.23±0.26)vs 假手術組(0.99±0.05)；t=4.71，P<0.001〕，而Cav-1顯著降低〔MCAO組(0.54±0.06)vs假手術組(0.98±0.07)，t=4.98，P<0.001〕。

2.3假手術組和MCAO組脾臟中miR-199a-5p和Cav-1表達水平比較 與假手術組相比，MCAO組脾臟miR-199a-5p表達顯著升高〔MCAO組(1.98±0.25) vs 假手術組(0.99±0.10)，t=3.59，P<0.01〕，而Cav-1顯著降低〔MCAO組(0.61±0.07)vs 假手術組(0.99±0.09)；t=3.25，P<0.01〕。

3 討 論

越來越多的證據顯示，免疫系統在IS發生后病理生理損傷方面發揮重要作用〔13〕。促炎/抗炎失衡可引發全身免疫狀態異常，這在腦卒中相關性感染的發生、發展進程中扮演著重要的角色〔14〕。正常條件下，由于血腦屏障的存在，中樞神經系統可免遭免疫細胞的攻擊。然而，腦缺血后，受損腦組織可被固有免疫細胞(星形膠質細胞、小膠質細胞)識別和活化，進而釋放炎性介質。同時，外周巨噬細胞、粒細胞、T細胞等可迅速浸潤于缺血腦組織，誘導炎性級聯反應的發生〔15〕。炎性級聯反應可誘導多種炎性因子如細胞因子、趨化因子、酶及氧自由基的釋放〔16〕。IS可引起系統性免疫應答及炎癥反應〔17,18〕。研究還發現，外周免疫在腦卒中損傷中扮演著不可忽略的重要角色，這些免疫應答改變可影響腦卒中的結局〔19〕。

最初的研究發現，Cav-1主要在內皮細胞、成纖維細胞及上皮細胞表達，可調控內皮細胞完整、氧化損傷及血管生成〔20,21〕。越來越多的證據表明，Cav-1可能在多種疾病如缺血再灌注損傷〔22,23〕及炎癥相關損傷中作為一種保護分子參與阻止細胞損傷〔24,25〕。同時還發現，在腦缺血再灌注損傷中，Cav-1表達下調與基質金屬蛋白酶-2、9活性增高有關，進而降低緊密連接蛋白表達，增加血腦屏障的通透性〔26〕。相反，過表達Cav-1可降低腦水腫的發生〔27〕。血清Cav-1水平降低與腦出血有關，可預測IS病人出血狀況〔28,29〕。而且，Cav-1可通過調控血紅素加氧酶1，下調Toll樣受體(TLR)4細胞通路活化〔30〕。本研究結果表明，IS患者PBMC中Cav-1表達下降，提示可能引起了巨噬細胞等免疫細胞活化，導致了外周免疫應答的產生；動物實驗同樣表明，Cav-1在脾臟組織及大腦皮質中表達降低。這些研究提示外周血、脾臟及腦組織Cav-1的改變影響了外周免疫及神經免疫應答。總的來說，從Cav-1參與調控腦卒中這個角度考慮，可將Cav-1作為藥物研發的一個靶點。因而，細胞特異性靶向調控Cav-1，如細胞特異性啟動子、帶有Cav-1的細胞靶向外泌體等方法的使用都可能有助于腦卒中后神經保護的發生〔6〕。

本課題組前期研究發現，IS患者外周血血清中存在一系列差異表達的miRNAs〔31〕。進一步研究也發現，miR-106b-5p反義核苷酸具有神經保護作用，且與降低神經細胞凋亡和氧化應激有關〔32〕。據文獻報道，miR-199a-5p特異表達在神經組織，可參與神經的再生、突起及突觸可塑性等生理過程〔33〕。本研究結果表明，miR-199a-5p在IS患者外周血PBMC及MCAO大鼠腦組織及脾臟中高表達。有研究表明，miR-199a-5p可靶向調控Cav-1，通過藥物調控AKT/miR-199a-5p/Cav-1信號通路，可降低肺囊性纖維化過度炎癥發生〔12〕。Cardenas等〔34〕證實miR-199a-5p通過調控Cav-1介導轉化生長因子(TGF)-β信號通路活化引起肺纖維化。也有學者發現，肝脂肪變性中miR-199a-5p/Cav-1/過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α信號軸發生紊亂〔35〕。這些報道提示，miR-199a-5p也可能通過調控Cav-1參與IS外周及神經免疫應答。下一步，我們將從體外實驗具體探討巨噬細胞中miR-199a-5p調控Cav-1的作用機制。