SATB2與miR-31、182對結直腸癌的靶向調控

楊洲 剛海菊 覃先蓬 賈貴清 周曉剛 趙高平 高本領

(1四川省人民醫院胃腸外科，四川 成都 610000；2成都市職業技術學院醫護分院護理教研室；3廣元市蒼溪縣中醫院)

結直腸癌是消化系統一種常見的惡性腫瘤，是世界上僅次于肺癌和乳腺癌的第3大常見腫瘤〔1，2〕。不論早期或晚期，結直腸癌的臨床癥狀均不明顯或不典型，因而容易被患者及臨床醫生所忽略，一旦確診多為晚期，錯過治療的最佳時機，患者多呈現轉移或手術切除易復發致死〔3〕。如何早診斷及早治療是結直腸癌的解決關鍵。隨著分子生物學發展，人們對結直腸癌的研究焦點轉移到基因層面。微小核糖核酸(miRNAs)是與腫瘤發生發展密切的一類小分子RNA，屬于非編碼的單鏈小分子RNA，主要參與基因轉錄后水平的調控〔4〕。miRNAs與腫瘤關系的研究主要在以下幾方面：①miRNAs主要位于基因組不穩定區域及癌相關區域；②miRNAs在正常細胞和惡性腫瘤細胞中的表達不同，幾乎所有的惡性腫瘤均呈異常表達。研究表明，miRNAs中既有致癌基因也有抑癌基因，通過參與調控細胞周期從而引發腫瘤〔5，6〕。另外，文獻顯示特定富含AT堿基DNA序列結合蛋白(SATB)2的低表達與結直腸癌的發生、發展及轉移緊密相關〔7,8〕。但關于結直腸癌中靶向調控SATB2的miRNAs研究和報道還較少。本研究主要分析結直腸癌發生、發展及轉移與靶向調控SATB2的相關miRNAs的內在聯系，為結直腸癌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗對象 收集四川省人民醫院病理科2015年9～10月收集的所有手術切除的結直腸標本，病檢確診為結直腸癌的標本6例為實驗組，正常結直腸標本6例為對照組。從距離標本中心≤1 cm的組織提取RNA，制作成12株細胞株，保存于-80℃冰箱。兩組標本的性別、年齡和體重指數等參數差異無統計學意義(P>0.05)。BALB/C 裸鼠，雌雄各半，購自上海腫瘤研究所動物實驗中心，動物質量合格證號：0024556。結直腸癌細胞系SW480均購自上海素爾生物科技有限公司。

1.2實驗儀器與試劑 TDM熒光偏振免疫自動分析儀(上海金鵬分析儀有限公司)，ABI7300熒光定量PCR儀上海智巖科學儀器有限公司，LT-16alpha 恒溫擴增基因檢測系統儀(北京藍譜生物科技有限公司)。CCK8(日本同仁化學公司)，其余試劑均由強森科技提供。SATB2單克隆抗體(美國ABI公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，PrimeScript RT reagent Kit試劑盒(美國Promega公司)和TaqMan@MicroRNA Assay試劑盒(美國ABI公司)，RPMI1640培養基和胎牛血清(美國Invitrogen公司)。

1.3研究方法

1.3.1篩選靶向調控SATB2候選miRNAs 利用miRBase、TargetScan和PicTar 3個常用的miRNA靶基因，結合miRNAs的芯片結果，使用預測數據庫進行數據分析，在靶向調控SATB2基因結直腸區域的12株細胞株中選擇候選miRNAs。

1.3.2測定候選miRNA表達 利用RT-PCR技術和熒光原位雜交技術，測定結直腸癌細胞系、結直腸癌組織及正常結直腸組織及細胞中miRNA表達。

1.3.3檢測miRNAs對調控結直腸癌轉移相關基因SATB2的靶效性 根據候選miRNAs預測結果，構建SATB2基因3′UTR突變性和野生型熒光素酶載體，與miRNA抑制物轉染、報告基因檢測和miRNA模擬物等技術手段相結合，檢驗候選miRNA是否對SATB2基因表達有靶向調控作用，確定miRNAs對調控結直腸癌轉移相關基因SATB2的靶效性。

1.3.4平板克隆實驗 慢病毒感染結直腸癌細胞SW480得到穩定過表達miR-31和miR-182的結直腸癌細胞株SW480/miR-31和SW480/ miR-182，以共同的空白細胞為對照SW480/Con。取細胞株，采用0.25%胰蛋白酶進行消化吹打成單個細胞并置于10%的胎牛血清的RPMI1640培養液中，稀釋、接種于培養皿中，培養2～3 w，當可通過肉眼觀察到培養皿中的克隆時，培養停止。棄上清液、浸洗并染色，放置在帶網格的透明膠片，對>10個細胞的克隆數通過顯微鏡進行計數，計算克隆形成率。

1.3.5細胞周期檢測 將SW480/miR-31、SW480/miR-182和對照SW480/Con細胞株消化成單個細胞懸液，離心、棄上清，浸洗、沉淀，于4℃固定24 h，離心、浸洗，加入500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)含50 μg/ml溴化啶(PI)、100 μg/ml RNaseA、0.2%TritonX-100，避光孵育30 min上機。

1.3.6熒光素酶活性檢測 根據構建的基因檢測系統，即突變型SATB2基因3′UTR系統，檢測轉染miR-31和miR-182后細胞內熒光素酶的活性。

1.3.7測定SATB2的逆轉作用 SATB2基因轉染后，采用CCK8增殖實驗檢測降低miR-31及miR-182表達的細胞體外增殖能力。慢病毒感染結直腸癌細胞SW480得到穩定過表達miR-31和miR-182的結直腸癌細胞株SW480/miR-31和W480/ miR-182，以共同的空白細胞為對照SW480/Con。采用CCK8試劑盒法，收集SW480/miR-31和SW480/miR-182細胞及SW480/Con的細胞種植于96孔板中，待細胞貼壁后(4～12 h)加藥，5%CO2，37℃孵育12 h，每孔中加入10 μl CCK8溶液，培養4 h，酶聯免疫檢測儀分析。

1.3.8細胞周期 SATB2基因轉染后，采用流式細胞儀檢測DLD1/miR-31和SW480/miR-31細胞的周期。

1.3.9運動能力 SATB2轉染后，采用劃痕實驗檢測細胞的運動能力。

1.3.10裸鼠成瘤實驗 取皮下瘤組織進盲腸原位移植于裸鼠皮下，作為實驗組，對照組皮下注射生理鹽水，分別為6只/組，2 w后處死，測定瘤的最大直徑和重量，采用免疫組化法檢測瘤體的miR-31和miR-182的表達情況。

1.4統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1候選miRNA篩選 預測SW480細胞的miRNA表達譜和靶向調控SATB2基因的miRNAs生物信息學結果并進行分析，與SATB23′UTR的保守區相比較，SW480細胞的miR-182(0.8±0.2 vs 0.4±0.2，t=3.464，P=0.018)、miR-26(0.9±0.3 vs 0.5±0.2，t=2.717，P=0.042)及miR-31(0.9±0.2 vs 0.3±0.2，t=5.196，P=0.003)表達水平升高明顯。導入miR-31和miR-182模擬物后，降低SW480細胞內SATB2表達水平(1.2±0.3 vs 0.8±0.2，t=2.717，P=0.042，n=6；0.9±0.2 vs 0.5±0.2，t=3.464，P=0.018，n=6)，而將其抑制物導入后，可明顯增加SW480細胞中的SATB2表達(1.2±0.3 vs 1.7±0.3，t=2.887，P=0.034，n=6；0.9±0.2 vs 1.5±0.4，t=3.286，P=0.022，n=6)。將miR-27b的抑制物和模擬物導入，SW480細胞內SATB2表達無明顯改變(1.2±0.3 vs 1.0±0.3，t=1.155，P=0.300，n=6；0.9±0.2 vs 0.7±0.2，t=1.732，P=0.144，n=6；1.2±0.3 vs 0.9±0.3，t=1.732，P=0.144，n=6；0.9±0.2 vs 0.6±0.3，t=2.038，P=0.097，n=6)，因此miR-31和miR-182是本次實驗考察調控SATB2候選miRNAs。

2.2結直腸組織miR-31和miR-182的表達差異 與對照組比較，實驗組癌組織中miR-182和miR-3表達明顯偏高(2.8±0.9 vs 0.3±0.2，t=6.642，P=0.000，n=6；2.4±0.5 vs 0.5±0.3，t=7.982，P=0.000，n=6)。實驗組中3例無淋巴轉移，3例淋巴轉移，與無淋巴轉移相比，有淋巴轉移的癌組織中miR-31和miR-182表達明顯高偏高 (4.5±1.0 vs 1.1±0.8，t=4.599，P=0.044，n=3；4.1±1.1 vs 0.7±0.6，t=4.700，P=0.042，n=3)。

2.3SW480/miR-31和SW480/miR-182細胞增殖能力 SW480/miR-31和SW480/miR-182細胞的增殖能力〔(1.6±0.4)%，(1.5±0.4)%，n=6〕明顯高于對照SW480/Con〔(0.9±0.4)%,n=6,t=3.429,P=0.019;t=2.598,P=0.048〕。實驗組細胞增殖可見圖1。

圖1 增殖狀態下的SW480/miR-31細胞

2.4SW480/miR-31和SW480/miR-182的平板克隆實驗 SW480/miR-31〔(4.3±1.2)%〕和SW480/miR-182細胞〔(4.0±1.1)%〕形成的克隆較對照SW480/Con細胞多〔(2.1±1.0)%，t=3.450，P=0.018;t=3.131，P=0.026，n=6〕，見圖2。

2.5SW480/miR-31和SW480/miR-182的細胞周期 與SW480/Con細胞G0/G1期(76.17%)、S期(14.36%)及G2/M期(9.47%)比較，SW480/miR-31，停留在G0/G1期的細胞減少(64.15%)，S期的細胞增多(24.60%)，G2/M期細胞增多(11.25%)，SW480/miR-182，G0/G1期(62.17%)的細胞減少，S期(24.38%)細胞增多，G2/M期(13.45%)細胞增多。

圖2 SW480/miR-31和SW480/Con細胞克隆數比較

2.6SW480/miR-31和SW480/miR-182的熒光素酶活性 與對照SW480/Con細胞比較，SW480/miR-31和SW480/miR-182的細胞內熒光素酶的活性(3.4±0.8 vs 1.5±0.5，t=4.933，P=0.004，n=6；2.7±0.6 vs 1.6±0.4，t=3.737，P=0.013，n=6)明顯降低，SATB2的表達(2.4±1.0 vs 0.9±0.5，t=3.286，P=0.022，n=6；2.5±1.1 vs 0.7±0.4，t=3.767,P=0.013，n=6)降低。

2.7SATB2的逆轉 SATB2基因轉染后，miR-31和miR-182細胞體外增殖能力均明顯降低〔(1.5±0.5)% vs (0.7±0.3)%，t=3.361，P=0.020，n=6；(1.6±0.5)% vs (0.8±0.4)%，t=3.060，P=0.028，n=6〕。

2.8SATB2基因轉染后細胞周期 與SW480/Con細胞G0/G1期(36.45%)、S期(27.95%)、G2/M期(20.14%)比較，SATB2基因轉染后，SW480/miR-31和SW480/miR-182細胞進入G0/G1期(75.16%、76.45%)增多，S期(11.35%、18.36%)細胞減少，G2/M期(13.48%、5.19%)細胞減少。

2.9運動能力 SATB2轉染后，SW480/miR-31和SW480/miR-182細胞的運動能力明顯降低〔(3.7±1.0)cm vs (1.8±0.6)cm，t=3.991，P=0.010，n=6；(3.6±1.2)cm vs (1.5±0.7)cm，t=3.703，P=0.014，n=6〕。

2.10裸鼠成瘤實驗結果 與對照組比，實驗組裸鼠的瘤體積和瘤重量均明顯增高〔(23.1±3.8)mm3vs (146.5±17.8)mm3，t=16.607，P=0.000，n=6；(1.0±0.3)g vs (2.9±0.5)g，t=7.982，P=0.000，n=6〕。

2.11裸鼠成瘤的miR-31和miR-182表達結果 與對照組比，實驗組瘤的miR-31和miR-182表達均明顯增高(1.2±0.6 vs 3.9±0.9，t=6.114，P=0.001，n=6；1.0±0.4 vs 2.8±0.6，t=6.114，P=0.002，n=6)，見圖3。實驗組裸鼠體內出現大量腫瘤轉移現象，淋巴轉移、肺轉移、腹腔轉移及肝轉移，對照組裸鼠無轉移病灶。

A和B：實驗組的miR-31和miR-182；D和E：對照組的miR-31和miR-182圖3 裸鼠成瘤皮下miR-31和miR-182表達(×100)

3 討 論

結腸鏡檢查和糞便隱血試驗是結直腸癌主要的兩種篩查方法〔9〕。結腸鏡檢查是結直腸癌診斷的金指標，可在鏡下摘除病理組織送病檢，但該方法具有侵入性，成本較高；糞便隱血試驗可以幫助早期發現結直腸癌，而且使用廣泛、費用較低，但敏感性和特異性均較低。因此急需探求新的診斷方法，以更好地對患者進行早期診斷和治療。SATB2的特異AT 序列，是較重要的核基質結合蛋白的一種，與核基質附著區相結合，促進染色質重建和基因重組〔10〕。SATB2能通過甲基化水平和蛋白乙酰化等途徑調控基因的表達，在腫瘤轉移、凋亡調控及免疫調節等方面均發揮著重要作用〔11〕。因在外周血中發現高濃度穩定的miRNAs和其在不同腫瘤中的異常表達，miRNAs有潛力作為結直腸癌早期篩查的非侵入性標志物〔12〕。已有實驗數據證實在多數腫瘤中存在特異的miRNAs的異常表達，同時發現來源于同一腫瘤個體不同組織的miRNAs的表達水平也有所不同，從而發揮抑癌基因或致癌基因作用〔13〕。本研究結果顯示，miR-31和miR-182能負性調控SATB2的表達，結直腸癌細胞的轉移與否與miR-31和miR-182密切相關，作用機制可能在于結直腸過表達miR-31和miR-182后，SW480細胞中的間葉標志物釋放的神經鈣黏素(N-Cadherin)增加，癌細胞的黏附能力、生存能力及運動能力增強。miR-31和miR-182能促進癌細胞增殖，并減少癌細胞凋亡，與結直腸的發生密切相關，由此可見通過觀察miR-31或miR-182的表達，有助于判斷結直腸癌患者的預后。SATB2能抑制miR-31和miR-182的體外繁殖和運動能力，促進癌細胞凋亡，減少癌細胞擴散。體內轉移實驗中將細胞懸液注射于裸鼠體內，觀察到miR-31和miR-182大量表達，裸鼠大量發生腫瘤轉移，而對照細胞組裸鼠無轉移灶形成，可能機制在于miR-31和miR-182大量表達，SW480細胞中的間葉標志物能釋放較多的促癌細胞分化因子波形蛋白(Vimentin)和Ki-67，進一步佐證miR-31和miR-182能通過抑制結直腸組織SATB2的表達，誘導上皮間質轉化，促進結直腸癌的轉移〔14,15〕。綜上所述，miR-31和miR-182在結直腸癌中高表達與SATB2表達具有顯著性相關，miR-31和miR-182可直接通過調控SATB2影響結直腸癌的增長侵襲。