蒙藥乳腺-Ⅰ號對大鼠乳腺增生組織中膜聯(lián)蛋白 A1、A2和翻譯調(diào)節(jié)腫瘤蛋白表達的影響

王忠超 薛露 于曉燕 孫波 任麗群 張彬

(1長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理教研室，吉林 長春 130031；2吉林大學(xué)第一醫(yī)院小兒血液科；3吉林大學(xué)藥學(xué)院；4內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科)

近年來乳腺增生發(fā)病率逐年升高，并趨向年輕化〔1〕。目前乳腺增生的發(fā)病機制并不清楚，有動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，乳腺增生與多種因素引起的乳腺細胞增殖與凋亡有關(guān)〔2,3〕。膜聯(lián)蛋白(ANX)A1、ANX A2和翻譯調(diào)節(jié)腫瘤蛋白(TCTP)這三種蛋白在近年來研究較廣泛，多項研究表明他們與細胞的增殖過程有關(guān)〔4,5〕。蒙藥乳腺I(M-I)號是內(nèi)蒙古自治區(qū)治療乳腺增生的傳統(tǒng)秘方,一直作為院內(nèi)制劑應(yīng)用于臨床。本實驗利用免疫組織化學(xué)的方法，檢測M-I號治療大鼠乳腺增生過程中對蛋白ANXA1，ANXA2和TCTP的調(diào)節(jié)作用，旨在為探索乳腺增生的發(fā)病機制和M-I號的治療機制提供實驗支持。

1 材料及方法

1.1分組及給藥 從40只雌性未孕Wistar大鼠(體重200～220 g)隨機取出8只作為正常組，其余動物連續(xù)25 d每天肌肉注射苯甲酸雌二醇(0.5 mg/kg)1次，隨后連續(xù)5 d每天肌肉注射黃體酮(4 mg/kg)1次，用于復(fù)制大鼠乳腺增生模型。同時正常組大鼠肌肉注射橄欖油。模型復(fù)制成功后，隨機分為3組即：模型組、M-I 低劑量組和M-I號高劑量組，后兩組的給藥方法和劑量分別是灌胃給予M-I號0.5 g/kg和3.0 g/kg，期間正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。給藥4 w后動物禁食12 h，取大鼠右側(cè)乳腺組織用4%多聚甲醛固定。Wistar大鼠購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK-(吉)2016-0003。苯甲酸雌二醇注射液和黃體酮注射液分別購買于杭州動物藥品廠和浙江仙居制藥股份有限公司，ANX A1、ANX A2、TCTP多克隆抗體、PV-6000檢測試劑盒均購自上海善然生物有限公司。內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供M-I號(哲衛(wèi)藥準(zhǔn)字：9604-79)。

1.2大鼠乳腺組織病理學(xué)檢查 取固定好的大鼠乳腺組織進行脫水、石蠟包埋、切片和HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察分析。將大鼠乳腺增生的程度進行分級：將無增生病理表現(xiàn)的正常乳腺組織計為1分，將乳腺腺泡數(shù)量增多、擴張，但腺泡及導(dǎo)管上皮無增生視為輕度增生記2分；將乳腺腺泡不但數(shù)目增多，且擴張及分泌現(xiàn)象嚴重，導(dǎo)管上皮出現(xiàn)多層或乳頭狀改變的視為重度增生計3分，對每組大鼠乳腺組織評分進行統(tǒng)計。

1.3免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠乳腺組織中ANXA1、TCTP的表達 應(yīng)用免疫組織化學(xué)Pv-6000通用型試劑盒檢測步驟如下：脫蠟、水化組織切片；3%過氧化氫(H2O2)去離子水孵育10 min，滴加一抗37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min。滴加親和素37℃孵育20 min，PBS沖洗2 min。滴加生物素-辣根過氧化物酶室溫孵育30 min，PBS液沖洗。應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液顯色；自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。Motic Images Advanced3.2軟件分析ANXA1、ANXA2、TCTP的免疫組織化學(xué)圖像。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1M-I號對大鼠乳腺組織ANXA1、ANXA2、TCTP表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠乳腺組織中ANXA1、ANXA2、TCTP表達水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，M-I號高劑量組乳腺組織中ANXA1、ANXA2、TCTP表達水平顯著下降(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 M-I號對大鼠乳腺組織ANXA1、ANXA2、TCTP表達的影響

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

圖1 免疫組織化學(xué)檢測大鼠乳腺組織中ANXA1、ANXA2、TCTP的表達(DAB，×400)

2.2乳腺組織病理改變 光學(xué)顯微鏡下可見，與正常組〔(1.00±0.00)分〕大鼠比較，模型組〔(2.58±0.30)分〕大鼠乳腺增生明顯，可見乳腺腺泡及導(dǎo)管大量增生，腺泡高度擴張、腺上皮細胞排列不規(guī)則，有脫落壞死的表現(xiàn)，腺泡內(nèi)分泌物較多，導(dǎo)管上皮呈多層和/或乳頭狀改變。與模型組比較，M-I號高、低劑量組〔(1.11±0.62)分、(1.68±0.59)分〕乳腺腺泡數(shù)及腔內(nèi)分泌物明顯減少，腺泡上皮物壞死，導(dǎo)管管腔變小體積縮小，其中高劑量組中的個別大鼠乳腺結(jié)構(gòu)接近正常。

3 討 論

ANX是鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族的一員。近年來發(fā)現(xiàn)，ANX在多個方面對細胞的功能有調(diào)節(jié)作用，包括炎性反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖、分化和凋亡等〔6〕。有學(xué)者研究ANX A1在乳腺癌組織中表達上調(diào)，另有學(xué)者研究其在乳腺癌組織中表達下調(diào)，雖然各家研究沒有達成一致，但足以說明ANX A1在乳腺癌發(fā)展過程中表達失常并扮演重要角色〔7～9〕。ANX A2的主要作用體現(xiàn)在血管生成及腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移方面，有研究表明在乳腺癌組織中ANXA2表達明顯增高〔10〕。TCTP是一種廣泛表達于真核生物中的高度保守的蛋白，近年來對TCTP的研究報道比較多見，研究范圍也比較廣泛，發(fā)現(xiàn)它具有抗凋亡、參與細胞免疫反應(yīng)、調(diào)控生長、干預(yù)腫瘤細胞增殖等多種生物過程。TCTP還能通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進人乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)化和增殖〔11〕。迄今為止，對上述三種蛋白與乳腺疾病的相關(guān)性研究主要針對乳腺癌方面，在乳腺增生組織中的研究還少有報道。本研究顯示，M-I號可以明顯改善乳腺增生大鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)，其治療機制涉及對ANXA1、ANXA2、TCTP表達的調(diào)節(jié)作用。