腦血疏口服液通過p38MAPK通路抑制帕金森病大鼠黑質神經炎癥反應

李港澳 李侃 陳超 莊文欣 趙盛男 呂娥 付文玉

(濰坊醫學院 1 2015級生物技術專業，山東 濰坊 261053；2 2016級生物技術專業；3醫學研究實驗中心；4 2015級藥學專業；5組織學與胚胎學教研室)

帕金森病(PD)是一種常見于中老年人的中樞神經系統退行性疾病，平均發病年齡為60歲左右。其主要臨床表現為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢平衡障礙等，同時伴有大量非運動癥狀。PD的基本病理變化是黑質致密部多巴胺(DA)能神經元的進行性變性死亡，由此引起紋狀體DA含量明顯減少而致病〔1〕。作為一種高病殘率、低病死率的神經退行性疾病，PD嚴重影響著老年人的生活質量〔2〕。目前，PD的發病機制尚未明確，但已有研究表明與遺傳、免疫炎癥反應、衰老、氧化應激等有關。中藥制劑腦血疏口服液(NXS)已廣泛應用于治療腦缺血性疾病，其主要作用為改善神經功能、增強吞噬細胞的能力、保護腦細胞等〔3〕。本課題組前期研究結果表明，NXS能夠抑制PD大鼠黑質膠質細胞的異常激活并減少炎性因子的表達，并未深入研究其抗炎機制〔4〕。p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路是重要的神經炎癥調控通路之一，可激活下游核因子(NF)-κB，并進而誘導多種促炎因子包括誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的過量表達〔5〕。本實驗旨在研究NXS是否通過調節p38MAPK通路抑制PD大鼠的神經炎癥反應。

1 材料和方法

1.1實驗動物 健康成年雄性Sprague Dawley大鼠(體重230～270 g)，購自濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司〔SCXK(魯)20140007〕。

1.2主要試劑與儀器 NXS由山東沃華醫藥科技股份有限公司提供(國藥準字Z20070059)；6-羥多巴胺(OHDA)、阿樸嗎啡(APO)、小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶(TH)多克隆抗體均為Sigma公司產品，兔抗大鼠p38MAPK和NF-κB p65多克隆抗體為Arigo公司產品；兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗體為Cell Signaling Technology產品；兔抗大鼠iNOS多克隆抗體購自Abcam公司；生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。腦立體定位儀(KOPF，美國)，微量移液器、低溫高速離心機(Eppendorf，德國)，CM1950冰凍切片機(LEICA，德國)，Olympus BX53正置熒光顯微鏡(Olympus，日本)，Nanoddrop 2000C超微量分光光度計(Thermo，美國)。

1.3模型制備 按照本實驗室以往采用的方法制備大鼠PD模型〔6〕。

1.4行為學檢測及分組 分別于紋狀體注射6-OHDA后第3周及大鼠灌胃30 d后，腹腔注射APO(0.5 ml/kg)誘導并觀察大鼠的旋轉行為。若大鼠出現以健側前肢或后肢為支點，首尾相接、身體環曲，逆時針旋轉，并伴有覓食樣嗅探等行為。連續觀察20 min，記錄大鼠旋轉圈數，平均旋轉速度以3～5 r/min為成功模型。將建模成功的大鼠隨機分為模型組、NXS組〔NXS灌胃，2.36 g/(kg·d)，共30 d〕，每組10只。另取10只正常大鼠作為對照組。對照組和模型組均以同樣體積的生理鹽水代替NXS灌胃。

1.5免疫組織化學法檢測黑質TH、小膠質細胞(Iba1)、NF-κB、iNOS和p38MAPK的表達 隨機選取各組大鼠5只，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，經左心室依次灌注溫生理鹽水及4%多聚甲醛固定液，斷頭取腦，置于固定液中后固定48 h(4℃)。經20%、25%、30%蔗糖磷酸鹽緩沖液梯度脫水，聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物(OCT)包埋，中腦黑質部位連續冠狀冰凍切片，片厚10 μm。腦切片經微波枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復后，按生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒操作說明進行染色。一抗抗體分別為TH(1∶800)、Iba1(1∶100)、NF-κB(1∶200)、iNOS(1∶100)、p38MAPK(1∶300)。

1.6Western印跡檢測Iba1、NF-κB、iNOS、p38MAPK和p-p38MAPK的蛋白表達量 隨機選取各組大鼠5只，灌胃后分離中腦左、右側黑質，置于-80℃儲存備用。實驗時按照99∶1的比例加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解緩沖液和苯甲基磺酰氟(PMSF)。充分勻漿后靜置10 min。4℃，12 000 r/min，離心20 min，吸取上清液，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定上清液蛋白質濃度。加入5× 上樣緩沖液，100℃沸水浴5 min，自然冷卻至室溫后放入-20℃保存。取50 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉印至0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1.5 h。依蛋白分子質量大小，將目的蛋白條帶分別移至Iba1(1∶800)、β-actin(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、iNOS(1∶1 000)、p38MAPK(1∶1 000)和p-p38MAPK(1∶1 000)一抗中，4℃過夜。室溫1 h，Tween-20 Tris磷酸鹽緩沖液(PBST)沖洗，置于辣根過氧化物酶(HRP)(1∶5 000)標記的二抗，室溫1～2 h。PBST沖洗后，電化學發光(ECL)檢測，Fluor Chem Q 蛋白印跡成像。

1.7統計學處理 參照李曉健等〔6〕的方法，計數黑質TH免疫陽性細胞，測定免疫陽性細胞的積分光密度(IOD)值，分析Western印跡結果。以損毀側黑質陽性細胞數/健側陽性細胞數表示陽性細胞的變化，以各目的蛋白/β-actin的比值來表示蛋白的相對表達量。應用Prism5.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1NXS對PD大鼠行為的影響 與灌胃前旋轉行為〔模型組(4.30±0.67)r/min；NXS組(4.20±0.67)r/min〕比較，灌胃后模型組〔(4.00±0.71)r/min〕無明顯變化，而NXS組旋轉圈數〔(1.60±0.42)r/min〕顯著降低(P<0.05)。對照組灌胃前、后無旋轉行為。

2.2NXS對PD大鼠黑質DA能神經元的影響 對照組雙側黑質和模型組正常側黑質可見大量TH陽性神經元，胞體較大，呈褐色深染，突起明顯。計數對照組雙側TH陽性細胞數之比為(1.02±0.04)。模型組損毀側黑質TH陽性細胞較少，散在，胞體染色淺，突起短少；損毀側與正常側TH陽性細胞數之比為(0.28±0.03)，較對照組明顯減少(P<0.01)。NXS組損毀側黑質TH陽性細胞數量明顯增多，與正常側細胞數之比為(0.70±0.04)，與模型組差異顯著(P<0.05，圖1)。

2.3NXS對PD大鼠黑質膠質細胞活化的影響 對照組雙側及模型組和NXS組正常側黑質Iba1陽性細胞數量較少，胞體小，染色淺。模型組損毀側黑質Iba1細胞胞體大，染色深，突起長，呈激活狀態。NXS組Iba1陽性細胞胞體變小，染色變淺(圖2)。模型組黑質Iba1的IOD值明顯高于對照組(P<0.05)，NXS組表達量顯著低于模型組(P<0.05，表1)。模型組Iba1蛋白表達量較對照組明顯增高(P<0.05)，而NXS組表達量較模型組顯著降低(P<0.05，表1，圖3)。

圖1 TH在各組黑質中表達(DAB,×100)

組別IODIba1NF-κBiNOSp38MAPK蛋白表達Iba1NF-κBiNOSp38MAPKp-p38MAPK對照組0.034±0.0100.033±0.0090.043±0.0030.051±0.0050.45±0.110.30±0.100.40±0.071.84±0.130.46±0.09模型組0.086±0.0111)0.086±0.0081)0.117±0.0121)0.131±0.0061)0.85±0.121)0.83±0.081)0.98±0.171)2.69±0.141)0.82±0.051)NXS組0.058±0.0062)0.056±0.0072)0.076±0.0082)0.093±0.0042)0.62±0.072)0.58±0.102)0.64±0.092)2.35±0.132)0.55±0.062)

與對照組比較:1)P<0.05;與模型組比較:2)P<0.05

圖2 各組黑質中膠質細胞各蛋白表達(DAB,×400)

圖3 各組黑質Iba1蛋白及β-actin表達

2.4NXS對PD大鼠黑質iNOS、NF-κB、p38MAPK和p-p38MAPK表達的影響 對照組iNOS、NF-κB和p38MAPK陽性細胞較少，染色較弱。模型組陽性細胞數目顯著增多，染色明顯增強。NXS組陽性細胞數量明顯減少，染色反應強度顯著減弱(圖2)。模型組黑質iNOS、NF-κB和p38MAPK的IOD值明顯高于對照組，NXS組表達則顯著低于模型組(P<0.05)。對照組iNOS、NF-κB、p38MAPK和p-p38MAPK僅少量表達，模型組表達量較對照組明顯增高(P<0.05)，NXS組蛋白表達較模型組顯著降低(P<0.05，圖4，表1)。

圖4 各組黑質NF-κB、iNOS、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白及β-actin表達

3 討 論

神經炎癥參與了PD的發生及發展過程，最終誘發DA能神經元進行性死亡的重要性已成共識〔7〕。小膠質細胞作為腦內固有免疫細胞，在PD發病過程中介導的炎癥發揮了重要作用。小膠質細胞激活后可誘導產生iNOS，iNOS是膠質細胞活化增生的標志物之一，iNOS能夠催化一氧化氮(NO)的產生，后者可抑制細胞DNA合成，與小膠質細胞激活后釋放的大量神經炎癥因子如白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等協同作用，最終導致DA能神經元凋亡或壞死〔8,9〕。Bournival等〔10〕發現，iNOS參與了1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導的DA能神經元的損傷過程。本實驗發現，神經毒素6-OHDA可誘導大鼠黑質小膠質細胞的活化，數量增多，iNOS表達水平明顯升高，PD大鼠中腦黑質內DA能神經元顯著減少，并出現大鼠行為學異常。

p38MAPK信號通路是非常保守的三級磷酸化酶促級聯反應，參與調控機體許多生理活動。大多數情況下，細胞外信號與受體特異性結合后通過MAPK激酶激酶作用于MAPK激酶(MKK)，使其磷酸化活化，而活化的MKK3/MKK6會作用于p38MAPK，使其磷酸化活化，即p-p38MAPK〔11〕。NF-κB是p38MAPK的重要下游信號因子，p-p38MAPK可誘導NF-κB活化，NF-κB可進入細胞核內與DNA上啟動子區域位點結合，參與調控下游相關基因(包括iNOS在內的多種炎癥蛋白基因)表達〔9,12〕，共同誘導PD大鼠黑質DA能神經元損傷〔13〕。

NXS的主要成分有黃芪、水蛭、大黃、石菖蒲、牛膝、川芎、牡丹皮等，可以減輕腦組織水腫，改善缺血、缺氧和減輕神經炎癥，發揮神經保護和神經營養作用〔14〕。黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分〔15〕，黃芪甲苷可以減輕由6-OHDA引起的DA能神經元減少，并具有促進神經軸突的生長等作用，提示黃芪甲苷具有聯合用藥治療PD的潛能〔16〕。水蛭中的水蛭素具有抗凝、抗炎和神經保護等功效〔17,18〕。紫杉醇水蛭素支架涂層復合物能明顯抑制脂多糖誘導的人冠狀動脈平滑肌細胞炎性活化過程中NF-κB p65的激活，顯著抑制下游炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達〔19〕。NXS能夠抑制PD大鼠黑質膠質細胞激活，減少TNF-α和環氧酶(COX)-2表達〔4〕。

綜上，NXS可能是通過抑制p38MAPK信號通路和NF-κB表達，進而抑制其下游調控的iNOS表達，最終減輕中腦黑質炎癥反應，從而發揮神經保護作用。