藤梨根提取物通過調控miR-451干預人食管鱗癌EC9706細胞的增殖

王濤 關徐濤 王冰 萬姜維 鄒善思 崔學梯 高萍

(河南中醫藥大學第一附屬醫院,河南 鄭州 450000)

食管惡性腫瘤的治療手段多樣，早期首選手術和放療，然而由于受教育的程度不同及生活條件的限制，患者對食管惡性腫瘤認識不深刻，大多數患者就診時已是中晚期，給臨床醫生增加了治療難度，一定程度上影響治療效果〔1〕。超過50%以上的中、晚期食管癌患者5年生存率相對較低，并且容易復發，轉移率高。中醫中藥在防治惡性腫瘤中發揮重要作用。本課題以食管鱗癌EC9706細胞為研究對象，觀察藤梨根提取物(RAE)對食管鱗癌細胞EC9706增殖抑制情況。

1 材料與方法

1.1藤梨根的制備〔2〕將1 kg的藤梨根(來自河南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房)用機器加工粉碎，然后將粉碎好的藤梨根用烘干機去除水分以備實驗。取烘干后的粗粉0.5 kg，另取2 L正丁醇溶液，將藤梨根粉加入溶液中泡制約1 d；反復回流3次，每次1 h，后進行提取、過濾；然后將3次的回流液合并在一起，真空干燥后將RPMI1640培養液加入其中；加熱、旋轉、溶解，制備成飽和的溶液；經過滅菌處理后可獲取500 ml的原液(濃度1 g/ml，pH3.8)。將原液進行稀釋，制備成不同的藥物濃度，再次過濾、滅菌處理后分裝，放入冰箱中以備使用(冰箱溫度5℃)。

1.2食管鱗癌細胞株EC9706的培養 食管鱗癌細胞株EC9706購于鄭州大學微生物教研室，放置在室溫37℃，5%CO2的條件下培養生長，培養液為RPMI1640，每2 d傳代1次，實驗時取對數生長期的細胞。

1.3試劑與儀器 PCR儀，美國PE公司PE9600型；流式細胞儀，美國BECTONDickinson公司；比色儀，芬蘭KHB公司；高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；高速冷凍離心機，日本HITACHI、20PR-5型；隔水式恒溫培養箱，上海精宏有限公司、GNP-9080型；穩壓恒流電泳儀，北京市六一儀器廠DYY-8B型；紫外分光光度儀，日本HITACHI、U-2001；電泳槽，北京六一儀器廠。

1.4實驗方法

1.4.1比色法測定RAE的細胞毒性〔3〕選取處于對數生長期的EC9706細胞，調整其濃度為2×105/ml。將RAE制備成1、5、10、100、1 000 μg/ml 5種不同的濃度。設96孔板，各孔加入100 μl細胞，加入RPMI1640培養液使總量達到200 μl。根據不同的濃度分別設立空白對照組，不同的濃度設3個平行孔，然后培養48 h(恒溫36℃，5%CO2飽和濕度)，再加入噻唑藍(MTT)(5 g/L)20 μl培養2 d后取出，放入平板離心機中離心，將上清液去除，在顯微鏡下觀察MTT藍色結晶數，加入150 μl二甲基亞砜使反應停止，在570 nm處用比色儀測定其吸光度(OD值)，反映存活細胞數目及其生物活性，計算RAE對細胞的抑制率。計算公式：抑制率=(對照孔OD值-用藥孔OD值)/對照孔OD值。

1.4.2RT-PCR方法檢測EC9706細胞株中miR-451表達水平〔4〕取對數生長期的EC9706細胞。將1 ml Trizol試劑加入25 ml的細胞培養瓶中，混合均勻，放入超凈臺內5 min，使細胞脫壁、黏液變稠。將液體轉入到離心管中〔先用1.5 ml焦碳酸二乙酯(DEPC)進行處理〕，加入氯仿0.2 ml，4℃、12 000 r/min離心15 min。取離心后的上層液體約5 μl，加入0.5 ml異丙醇，震蕩使其均勻，放置室溫約15 min。倒掉上清后加入75%滅菌異丙醇1 ml，將管壁上的RNA沉淀、飄起，然后進行洗滌，4℃、7 500 r/min離心10 min后，所得沉淀即是提取的總RNA。在空氣中干燥10 min，加入20 μl DEPC水。-80℃的低溫冰箱中保存備用。

首先逆轉錄生成cDNA，反應體系：4×dNTP 1 μl，miR-RT引物(序列：5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTG-GCA3′)1 μl，5×RT緩沖液4 μl，M-MLV 0.5 μl，總RNA 1 μl，RNaseFreeH2O補足20 μl體積，反應程序：37℃ 60 min，85℃ 10 min。生成cDNA后再行PCR擴增，擴增體系：miR-451特異性引物1 μl(引物序列：前向：5′TCCGATTGAGTCATTACCAT3′，反向5′GTGCAGGGTCCGAGGT3′)，2×PCR緩沖液20 μl，Taq酶0.2 μl，miRNA逆轉錄產物cDNA 1 μl，ddH2O補足40 μl體積;反應程序：95℃ 3 min預變性；95℃ 15 s，65℃ 45 s，循環40次。全部反應均設置3個復孔，擴增儀為ABI7500Fast儀器。

1.5統計學分析 采用SPSS19.0軟件，采用線性回歸計算IC50，組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1RAE的細胞毒性作用 當RAE濃度≤10 μg/ml時，與空白對照組相比，細胞的抑制率差異無統計學意義(P>0.05)，RAE 100 μg/ml和1 000 μg/ml的抑制率與空白對照組比較差異有顯著統計學意義(P<0.05)，見表1。因此本實驗選取RAE 10 μg/ml為合適的實驗濃度。

2.2食管鱗癌細胞EC9706中miR-451表達水平的測定 食管鱗癌細胞株中miR-451相對表達量(4.14±1.06)明顯低于空白對照組(11.68±3.86，P<0.01)。

表1 RAE的細胞毒性檢測結果

與空白對照組比較：1)P<0.05

2.3各組miR-451表達水平比較 對照組為食管鱗癌細胞株EC9706+RPMI1640培養液，實驗組為食管鱗癌細胞株EC9706+RAE，實驗組的miR-451基因表達水平(7.98±0.85)與對照組(10.44±0.73)比較差異有統計學意義(t=6.919，P<0.05)。說明RAE可以上調食管鱗癌細胞miR-451基因的表達水平。RT-PCR電泳圖見圖1。

1：DNA marker;2、3：實驗組；4：對照組圖1 各組RT-PCR電泳圖

3 討 論

隨著醫學技術的進步，分子靶向藥物在治療各種惡性腫瘤方面起著越來越重要的作用。不同的細胞發生癌變的途徑不同，分子靶向治療就是阻斷那些容易發生變性的不同環節，有的對細胞信號的傳導通路產生阻斷，有的則是針對抑癌或者原癌基因；不同的細胞因子及其受體、腫瘤新生血管形成這些也是靶向藥物研究的對象。以分子水平為出發點，探索惡性腫瘤生物學行為，尋找新的治療手段阻斷其發展，進而達到控制惡性腫瘤細胞生長，甚至達到腫瘤細胞消失是一種新的治療模式。

食管癌是多種基因和飲食、環境、工作壓力等多因素相互作用形成的一種惡性消化道腫瘤，主要有兩大病理類型：食管腺癌及食管鱗癌。根據流行病學研究結果，食管腺癌主要發生在西方發達國家〔5〕，而食管鱗癌主要發生在以我國為主的發展中國家，其中50%以上發生在河南林縣、北部太行山區、蘇北地區、川北地區、潮汕地區及新疆哈薩克族聚居地區等〔3〕。

傳統醫學對于癌癥病毒病機的認識可概括為“劫掠精微，耗傷正氣，阻滯氣機，兇險難愈，傳舍為患”，治療上采用辨證論治，四診合參，以整體觀念為指導，基本治法為扶正抗癌解毒〔6〕。以祖國傳統醫學辨證論治用藥為根基，優先考慮臨床抗癌療效明顯的中藥進行研究，尋找其中毒性較低、對化療起到增敏作用的中草藥，并研究其分子作用機制及基因水平作用靶點，對于推廣和普及中醫藥在抗腫瘤方面的作用、提高不同腫瘤的綜合治療效果大有裨益。古書《開寶本草》中首次記載了藤梨根，稱其為獼猴桃根，作用廣泛，用于多種疾病的治療，尤其在腫瘤方面用處較多〔4〕。藤梨根具有抑制惡性腫瘤生長、調節機體免疫的作用，可用于治療各種消化道惡性腫瘤如肝癌、食管癌、胃癌等〔7,8〕。臨床實驗研究〔9〕證實，在體外以藤梨根為基礎的復方制劑通過多種不同途徑發揮抗癌作用，能夠減緩各種腫瘤的生長速度。本課題組前期研究可以表明，RAE可以調控食管鱗癌細胞中多種基因的mRNA表達。而近期的研究表明，多種基因表達的調控與非蛋白質編碼miRNA-451的表達上調有關〔10〕。

miRNA并不是編碼蛋白，然而它們但卻在細胞的增殖、分化、凋亡和基因調控、免疫應答及腫瘤的發生、發展和預后的過程中發揮了重要作用。在腫瘤的發生及發展過程中，miRNA發揮兩種作用。很多文獻已報道，諸如在食管、胃、大腸及肝等惡性腫瘤組織〔11〕中miRNA表達失常。隨著醫學技術的進步，依靠基因芯片技術、原位雜交技術等尋找非蛋白miRNA在各種消化道惡性腫瘤細胞中的表達，并且分析這些miRNA引起腫瘤的機制及其引發腫瘤的靶點，可以為探索各種消化道腫瘤的發病機制及治療手段開拓新的領域〔12〕。

本次實驗結果證實，RAE有一定的細胞毒性，并且該提取物可以上調食管鱗癌細胞miR-451的表達水平。今后我課題組將從不同證型的動物實驗出發，探討藤梨根對不同證型食管癌模型的抑制作用。