養肝解郁顆粒治療非酒精性脂肪性肝病肝纖維化的藥效學

冷炎 楊明 歐喜燕 成光宇 蔣惠軍 陳星宇

(長春中醫藥大學附屬醫院，吉林 長春 130021)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝損傷〔1〕，已成為發達國家、中國沿海地區慢性肝病的主要原因。且發病率隨年齡增長而升高〔2〕。養肝解郁顆粒為丹梔逍遙散化裁而來，作為院內制劑已經應用于治療各種慢性肝炎伴有抑郁狀態患者，取得了很好的保肝降酶療效，且臨床中發現該制劑對NAFLD肝纖維化的血脂、肝功及肝纖維化程度均具有一定改善作用，本研究主要觀察養肝解郁顆粒治療NAFLD肝纖維化的療效。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 SD大鼠120只，雄性，220～250 g，KM小鼠60只，雄性，18～22 g(遼寧長生生物技術有限公司)。藥品與試劑：養肝解郁顆粒(長春中醫藥大學附屬醫院制劑中心)；多烯磷脂酰膽堿膠囊(賽諾菲制藥有限公司)；中/長鏈脂肪乳注射液(廣州百特僑光醫療用品有限公司)；四氯化碳(CCl4，北京化工廠)；注射用鹽酸四環素(北京賽弗制藥股份有限公司)；膽固醇(TC，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；氨基甲酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司)；甲醛溶液(沈陽力誠試劑廠)；總TC測試試劑盒(COD-PAP法)，三酰甘油(TG)測試試劑盒(GPO-PAP法)，中生北控生物科技股份有限公司產品；羥脯氨酸(HYP)、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、透明質酸(HA)、 Ⅲ型前膠原蛋白(PⅢP)、層黏蛋白(LN)酶聯免疫測試試劑盒，為美國R&D公司產品。實驗儀器：紫外/可見分光光度計(美國Perkin Elmer公司)；Heraeus臺式離心機Stratos(德國賀利氏公司)；電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1NAFLD肝纖維化模型建立 大鼠高脂高糖結合CCl4復合因素法：足量18%蔗糖溶液自由飲用，同時給予脂肪乳灌胃(10 ml/kg)，并于其背部皮下注射40%的CCl4花生油溶劑(0.1 ml/100 g)，3次/w。每周稱重2次，調整給藥劑量。大鼠高脂結合氧四環素復合因素法：給予復合高脂飼料飲食〔77%基礎飼料基礎上，加入3% TC、10%豬油和10%蛋黃粉。投食量：25 g/(鼠·d)〕，并按10 mg/100 g劑量給予氧四環素腹腔注射，每5 d給藥1次。小鼠高脂結合CCl4復合因素法：給予復合高脂飼料飲食，并于第2周末開始腹腔注射5%的CCl4花生油溶劑(0.01 ml/g)，3次/w。各組均持續造模8 w。

1.2.2實驗分組及給藥方法 動物適應環境7 d后按體重隨機分組為對照組、模型組、陽性(多烯磷脂酰膽堿膠囊)組、高、中、低劑量組。各組于建模后當日起每天灌胃給藥1次，陽性組給予多烯磷脂酰膽堿膠囊〔0.25 g/(kg·d)〕，高、中、低劑量組分別給予養肝解郁顆粒〔1.728、0.864、0.432 g/(kg·d)〕，對照組及模型組給予等劑量蒸餾水，連續8 w，每周稱重2次，以調整給藥劑量。于8 w末，動物禁食不禁水12 h，于末次給藥60 min后以20%烏來糖溶液麻醉后，腹主動脈取血，4℃，3 000 r/min，10 min，取血清保存備用。

1.2.3檢測指標

1.2.3.1血清學指標檢測 依照試劑盒方法檢測大鼠血清中TC、TG含量；HYP、MMP-9含量；小鼠血清中HA、PⅢP、LN含量。

1.2.3.2肝病理組織學檢查 甲醛固定，HE染色，光鏡觀察。病變評價參考衛生部《保健食品檢測與評價技術規范2003版》中關于對化學性肝損傷有輔助保護作用檢驗方法。觀察肝細胞變性(脂肪變性、水樣變性、胞質凝聚、氣球樣變)、肝細胞壞死和炎癥改變等。肝臟病變得分=肝細胞變性得分(氣球樣變得分+脂肪變性得分+胞質凝聚得分+水樣變性得分)×1+ 肝細胞炎癥改變得分×1 + 肝細胞壞死得分×2。

1.3統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組血脂水平比較 與對照組比較，模型組TC、TG含量均顯著升高(P<0.01,P<0.001)。陽性組及高劑量組TC、TG含量與模型組比較均明顯下降(P<0.01，P<0.05)。中劑量組TC含量與模型組比較明顯下降(P<0.05)，中劑量組TG含量、低劑量組TG、TC含量與模型組比較有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2各血清HYP、MMP-9含量比較 與對照組比較，模型組HYP、MMP-9含量顯著升高(P<0.05,P<0.001)。陽性組及高劑量組與模型組比較HYP、MMP-9含量均明顯下降(P<0.01,P<0.001,P<0.05)；中、低劑量組與模型組比較均有下降趨勢，但只有中劑量組HYP含量及高脂高糖結合CCL4復合因素法MMP-9含量、低劑量組高脂高糖結合CCL4復合因素法HYP含量差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。見表1。

2.3各組血清HA、PⅢP、LN含量比較(高脂結合CCl4復合因素法) 對照組、陽性組、高、中劑量組血清HA、PⅢP、LN含量與模型組比較均明顯下降(P<0.05,P<0.01,P<0.001)，低劑量組動物血清中HA、PⅢP、LN含量與模型組比較有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4各組病理形態評分比較 對照組、陽性組及高、中劑量組病理形態評分與模型組比較均明顯下降(P<0.05，P<0.01)。低劑量組動物病理形態評分與模型組比較有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組血脂、血清HYP、MMP-9含量比較

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001；下表同

表2 各組血清HA、PⅢP、LN含量(高脂結合CCl4復合因素法)及肝臟病理評分比較

3 討 論

養肝解郁顆粒是丹梔逍遙散加減而來，具有保肝降酶、緩解肝纖維化的作用。張寧等〔3〕運用代謝組學方法探討逍遙散對大鼠肝纖維化保護作用的機理，發現逍遙散具有改善肝功能、調節脂肪酸代謝、促進氨基酸生成等多方面作用，可能是其治療肝纖維化的作用機制。白芍總苷具有抗急性肝損傷、NAFLD、慢性肝纖維化等多種保肝作用〔4～6〕。丹皮酚能夠緩解肝纖維化過程，其作用機制可能與降低氧化應激水平有關〔7〕。茯苓皮水提取物對CCl4誘導的大鼠肝纖維化具有良好的改善作用，其機制可能與抑制機體脂質過氧化有關〔8〕。梔子苷能夠通過顯著抑制肝組織中轉化生長因子(TGF)-β1和α-平滑肌肌動蛋白(SMA)的蛋白表達，改善肝纖維化〔9〕。

本實驗結果提示養肝解郁顆粒具有降低血脂的作用；能夠顯著緩解肝纖維化，模型大鼠、小鼠病理形態可見模型組肝細胞發生氣球樣變性為主，肝細胞胞質疏松，肝細胞明顯的壞死和匯管區炎細胞浸潤，應用養肝解郁顆粒干預后，肝細胞氣球樣變的程度減輕，肝細胞以疏松變性為主，少見肝細胞壞死，少見炎細胞浸潤，有效減輕肝損傷程度。

本實驗部分結果無顯著性差異，可能因本實驗總體治療時間較短所致，其中HYP、HA差異性較為顯著，考慮該指標反應肝纖維化早期改變較為敏感。綜上，養肝解郁顆粒具有明確的保肝降酶作用，可在一定程度上緩解肝纖維化程度。