微小RNA-29a在肺動脈高壓模型大鼠肺動脈血管壁組織中的表達及對肺動脈高壓大鼠的影響

高繼勇 李福海

(山東大學 1臨床醫學院，山東 濟南 250012；2齊魯醫院)

肺動脈高壓目前尚無特效療法，經手術治療后患者的預后往往不理想，而藥物治療包括前列腺素等，均能對內皮細胞的舒縮進行調節，能夠一定程度改善肺動脈高壓持續升高，但遠期患者的存活率相對較低〔1,2〕。微小RNA(miRNA)由約23個核苷酸單鏈RNA分子組成，其主要作用為參與體內基因的調控，對于細胞有調節作用。miRNA表現形式并不統一，可以使多個miRNA對相同基因產生調節作用，也可以由單一的miRNA參與數個靶基因，因此在生物學中可以由miRNA對基因組進行不同的調節表達。研究證實〔3〕，miRNA在人體中參與了三分之一的基因調節，是人體內重要的調節機制。miRNA-29a是miRNA-29家族中的重要組成，有學者在大鼠實驗中發現miRNA-29的表達直接影響了機體臟器功能的正常作用機制，可引起心血管疾病，是導致動脈粥樣硬化的獨立危險因素〔4〕。

1 材料與方法

1.1動物和材料 選取36只雄性Wistar大鼠，重量200～250 g，平均(234.1±11.8)g，清潔級，由實驗動物中心提供，在恒溫、恒濕環境中飼養。野百合堿由成都德銳可生物科技有限公司提供，將野百合堿與1 mol/L稀鹽酸融合配比，制成濃度為1%的混合溶液，用氫氧化鉀調節溶液pH7.2，之后與生理鹽水進行配置備用。miRNA-29a-NC和miRNA-29a-mimic均由上海銳賽生物有限公司提供。

1.2方法

1.2.1大鼠模型建立 將36只大鼠隨機分為對照組(正常大鼠)、第一組(野百合堿誘導)、第二組(miRNA-29a-NC尾注)和第三組(miRNA-29a-mimic尾注)，每組8只。第一、二、三組大鼠均給予皮下注射野百合堿預制溶液50 mg/kg，注射后保持之前的飼養環境，正常飲水，待注射1個月后對第二、三組分別使用胰島素注射器進行尾靜脈注射miRNA-29a-NC和miRNA-29a-mimic。

1.2.2檢測方法

1.2.2.1miRNA-29a表達測定 從試劑盒中提取總RNA，根據說明書操作。miRNA-29a上游引物5′CGCATCCAGACCAACAACAACC-3′;下游引物5′AGAGCCGCACAGCATTCAGG-3′；內參照U6：上游引物5′CATGCCATTGAGAAAGCCTTCC-3′，下游引物5′AGAGTTGTCCCGATGATCTCC-3′；PCR反應體積25 μl，反應條件：預變性95℃、30 s；循環條件：95℃、10 s，60℃、30 s，40個循環。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統掃描。

1.2.2.2血流動力學檢測 四組大鼠按照體重每100 g腹腔注射50 U肝素〔5,6〕，注射完成5 min后應用10%氨基甲酸乙酯進行腹腔麻醉，通過右頸靜脈施行右心室插管操作，選取20號套管針從右心室穿刺直達肺動脈主干，詳細記錄每組大鼠的肺動脈壓，之后將導管退出，于大鼠近心端進行結扎，再由右頸總動脈處進行導管置入，記錄體循環動脈壓。

1.2.2.3形態分析 完成以上檢測后將大鼠處死，完整解剖分離大鼠左肺，并進行切片、染色處理，在光學顯微鏡下觀察大鼠肺動脈組織的形態特征，利用計算機圖像分析中膜厚度與血管直徑的百分比(WT%)及中膜面積與血管壁面積的百分比(WA%)。

1.3統計學方法 應用SPSS18.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1miRNA-29a表達對比 四組miRNA-29a表達差異較大，第一、二組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；且轉染miRNA-29a-mimic后1個月，第三組miRNA-29a表達明顯升高，與第一、二組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2血流動力學對比 除對照組外，其余三組肺動脈壓明顯升高，與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05)；且第三組肺動脈壓明顯低于第二組(P<0.05)。四組體循環動脈壓差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

與對照組比較：1)P<0.05；與第一、二組比較：2)P<0.05圖1 各組miRNA-29a表達

組別肺動脈壓體循環動脈壓對照組20.83±1.7685.26±5.31第一組37.91±2.081)84.78±5.16第二組36.54±1.991)84.35±4.97第三組29.32±2.841)2)86.23±5.28

與對照組比較：1)P<0.05；與第一、二組比較：2)P<0.05；下表同

2.3肺動脈形態結構 第一、二、三組肺動脈中膜均有增厚情況，可見到明顯的血管重構，與對照組比較，WT%與WA%差異均有統計學意義(P<0.05)，第三組與第一、二組比較，轉染miRNA-29a-mimic大鼠的中膜增厚程度較低，WT%與WA%差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 四組WT%與WA%對比

3 討 論

調查發現〔7〕，在動植物及病毒中都存在著miRNA分子，已有兩萬多個miRNA分子被記錄，miRNA普遍以拷貝或者基因簇的形式結合在基因組中。miRNA在基因中多處于高度保守位置，并且序列中表現出同源性，高度保守的位置與miRNA的生物作用有直接的聯系，故miRNA能夠準確反映靶基因的進化機制及功能。miRNA最先在線蟲中被發現，通過未知的蛋白抑制方式達到了抑制蛋白質合成的目的，應用miRNA對一組關鍵基因進行調控，對線蟲的正常發育起到了有效的控制作用〔8〕。高度保守的RNA分子通過與非編碼區結合，從而實現抑制翻譯作用，加速了靶基因的降解作用〔9〕。

金強等〔10〕將24只大鼠平均分成四組，應用野百合堿對大鼠肺動脈高壓進行誘導，并通過腺病毒誘導型一氧化氮合成酶(eNOS)介導基因轉移，達到對大鼠肺組織表達調控的作用，結果顯示明顯減少了白細胞介素(IL)-6的水平；腺病毒eNOS介導基因轉移能夠促進肺血管擴張，同時對炎癥因子的活性抑制作用明顯，以此達到肺動脈高壓大鼠肺部血管結構重建的作用，同時有效調控大鼠的肺動脈壓力。野百合堿是一種豆科類植物，歸屬于野百合，臨床中多用于肺動脈高壓的動物模型誘導〔11〕。本研究結果發現，當機體出現miRNA-29a低表達時能夠導致肺動脈病變及血壓升高，轉染miRNA-29a-mimic后能夠調控肺動脈壓，改善了肺血管組織的重構，推測miRNA-29a的表達水平能夠影響機體的肺組織狀況，轉染miRNA-29a-mimic后改善效果明顯，表明miRNA-29a在野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠模型肺組織血管壁中能夠阻滯肺組織細胞的凋亡，恢復重建血管結構，降低肺動脈壓水平。鄭常龍等〔12〕用野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓，觀察到轉化生長因子(TGF)-β1/Smad2信號通路也參與了肺動脈高壓形成的過程，同時野百合堿注射后模型大鼠的體重明顯低于正常大鼠體重(P<0.05)；野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓主要通過對信號通路的干預，達到影響大鼠肺動脈血管壁的目的。常成等〔13〕認為野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓形成主要通過激活Jagged2/Notch3信號分子。肺動脈高壓形成受到多種因素的影響，遺傳、基因變異、心血管病等都會導致肺動脈高壓發生，掌握信號通路表達的作用能夠為臨床治療打開研究的新領域，改善患者的預后。

綜上所述，miRNA-29a表達水平對于肺動脈壓有直接影響，高表達miRNA-29a能夠改善肺動脈血管壁厚度，同時降低肺動脈壓水平。這一研究結果可在臨床研究中進行深入討論，充分掌握miRNA-29a表達的作用機制，為肺動脈高壓的治療提供參考依據。