14-3-3ζ和p-Bad在Lewis肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及意義

梁帥 熊茂林 王宇彤 李福智 侯陽(yáng)

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,遼寧 錦州 121001；2附屬第三醫(yī)院；3生命科學(xué)研究院)

肺癌發(fā)生與吸煙、環(huán)境污染及遺傳等密切相關(guān)，伴隨多種癌基因過(guò)度表達(dá)及腫瘤抑制基因失活〔1〕。肺癌起病隱匿，進(jìn)展迅猛，早期發(fā)現(xiàn)難，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，現(xiàn)有放化療藥物治療效果差，5年存活率只有15%～20%〔1〕。樹(shù)突細(xì)胞(DC)具有免疫激活和誘導(dǎo)免疫耐受的生物學(xué)特性，在抗感染免疫、移植免疫、腫瘤免疫等方面意義重大。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(CIK)細(xì)胞不是一種單一的細(xì)胞群，而是幾種細(xì)胞混合的異質(zhì)細(xì)胞群。作為一種新型、高效的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，CIK 細(xì)胞參與內(nèi)源性抗原提呈、誘導(dǎo)對(duì)病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的殺傷和溶解，因而作為非限制性免疫活性細(xì)胞得到了廣泛應(yīng)用。近年研究表明，磷酸化(p)-Bad在多種細(xì)胞中表達(dá)，可通過(guò)參與某些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響細(xì)胞凋亡的全過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)初步探DC調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(DC-CIK細(xì)胞)對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制。

1 資料和方法

1.1細(xì)胞及試劑 Lewis肺癌細(xì)胞株由錦州醫(yī)科大學(xué)高校分子細(xì)胞生物學(xué)與新藥開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蘇榮健博士惠贈(zèng)。DC-CIK細(xì)胞取自健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行制備，用于實(shí)驗(yàn)研究。噻唑藍(lán)(MTT)，Sigma公司；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基，GIBCO公司； p-Bad兔多克隆抗體、14-3-3ζ兔多克隆抗體，Santa Cruz公司。

1.2方法 從液氮中取出凍存的Lewis肺癌細(xì)胞株，復(fù)蘇后使用。常規(guī)方法復(fù)蘇后將Lewis細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，貼壁生長(zhǎng)者為存活細(xì)胞，按照1∶2～1∶4進(jìn)行傳代培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后即可用于實(shí)驗(yàn)。嚴(yán)格按照文獻(xiàn)要求的步驟進(jìn)行CIK細(xì)胞的體外培養(yǎng)〔2〕。第14天收獲細(xì)胞。用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸制備DC，第0天加入粒-巨集落刺激因子〔含1 000 U/ml的重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、500 U/ml的白細(xì)胞介素(IL)-4〕。每隔2～3 d換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液1次，并補(bǔ)加細(xì)胞因子，并加入rhTNF-α(200 U/ml)，誘導(dǎo)DCs成熟。將DC、CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，在第8天將收獲的細(xì)胞按1∶5混合培養(yǎng)，共培養(yǎng)3 d。

1.3DC-CIK細(xì)胞與Lewis肺癌細(xì)胞株共培養(yǎng)體系的建立 利用Transwell培養(yǎng)板建立共培養(yǎng)體系。實(shí)驗(yàn)分四組，分別為DC-CIK組、CIK組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組和正常對(duì)照組。在Transwell系統(tǒng)上層小室中分別加入DC-CIK細(xì)胞、CIK細(xì)胞和PBS，另一組不加任何成分；下室加入Lewis肺癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系。置于5%CO2孵箱、37℃條件下培養(yǎng)。在3、5、7 d鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法 MTT比色法檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞活力。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A值/正常對(duì)照組A值×100%。

1.5Western印跡檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞中14-3-3ζ、p-Bad蛋白表達(dá)變化 嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1DC及CIK細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在400光鏡下DC呈貼壁生長(zhǎng)，散在分布，也有成簇聚團(tuán)生長(zhǎng)，表面伸出毛刺狀不規(guī)則突起，具有DC典型的樹(shù)突形狀特征。CIK細(xì)胞在200倍光鏡下細(xì)胞體積增大，胞核增大，胞質(zhì)增多，部分細(xì)胞集落生長(zhǎng)。

2.2共培養(yǎng)后CIK組、DC-CIK組Lewis肺癌細(xì)胞形態(tài)光鏡觀察 3 d時(shí)各組Lewis肺癌細(xì)胞沒(méi)有顯著改變，細(xì)胞輪廓清晰。5 d時(shí)CIK組Lewis肺癌細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)于DC-CIK組；DC-CIK組可見(jiàn)細(xì)胞膨脹，胞質(zhì)崩解，釋放之后細(xì)胞萎縮，細(xì)胞間隙增大。7 d時(shí)CIK組出現(xiàn)突起萎縮，細(xì)胞間隙繼續(xù)增大；DC-CIK組部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡，可見(jiàn)死亡的細(xì)胞斑片，細(xì)胞形態(tài)改變較大，體積明顯縮小并與周?chē)?xì)胞脫離，細(xì)胞間連接消失。

2.3各組Lewis肺癌細(xì)胞存活率 DC-CIK組細(xì)胞存活率〔(69.45±1.34)%〕明顯低于CIK組〔(79.23±1.22)%〕、PBS組〔(95.52±0.22)%〕和正常對(duì)照組〔(100.00±0.00)%〕，差異均有顯著性(P<0.01)。

2.4Western印跡檢測(cè)14-3-3ζ、p-Bad蛋白的表達(dá) 以Transwell培養(yǎng)板共培養(yǎng)7 d，Lewis肺癌細(xì)胞中14-3-3ζ、p-Bad的表達(dá)均降低。見(jiàn)圖1，2。

圖1 Western印跡檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞中14-3-3ζ蛋白表達(dá)

圖2 Western印跡檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞中p-Bad蛋白表達(dá)

3 討 論

肺癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病之一，其惡性程度高、預(yù)后差，已經(jīng)成為各種癌癥中導(dǎo)致死亡的主要原因〔3〕。肺癌的病因尚不明確，無(wú)法達(dá)到病因治療。手術(shù)切除是目前主要的治療方式，結(jié)合放療、化療等綜合治療可提高病人的5年生存率。但放療、化療等治療方式存在有效率的問(wèn)題，未能做到所有患者均受益。因此，采用免疫治療在內(nèi)的多學(xué)科聯(lián)合治療，才有望達(dá)到徹底消滅腫瘤細(xì)胞或者帶瘤生存的理想狀態(tài)。多項(xiàng)研究〔4，5〕報(bào)道，DC疫苗、化療和CIK細(xì)胞三者聯(lián)合治療腫瘤已經(jīng)取得了一定成就，這有可能成為未來(lái)肺癌治療的新趨勢(shì)。因此，本文建立共培養(yǎng)體系將DC-CIK細(xì)胞與Lewis 肺癌細(xì)胞株共同培養(yǎng)，初步探討DC-CIK細(xì)胞對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。本研究表明，DC-CIK細(xì)胞能夠降低體外培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞的存活率，且其作用比單純應(yīng)用CIK細(xì)胞明顯增強(qiáng)。凋亡是細(xì)胞的程序化死亡過(guò)程。一般認(rèn)為，正是由于凋亡受到抑制，才導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖而發(fā)展為腫瘤細(xì)胞。因此，關(guān)于細(xì)胞凋亡與腫瘤關(guān)系的研究是目前腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究的熱點(diǎn)。本文利用Western印跡方法檢測(cè)了Lewis肺癌細(xì)胞中14-3-3ζ蛋白含量的變化，發(fā)現(xiàn)DC-CIK組14-3-3ζ蛋白含量明顯低于其他組，表明DC-CIK細(xì)胞可以降低體外培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞中14-3-3ζ蛋白的表達(dá)。本文還檢測(cè)了另外一個(gè)凋亡相關(guān)因子p-Bad在Lewis肺癌細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DC-CIK組p-Bad蛋白含量也明顯低于其他各組。抗腫瘤免疫以細(xì)胞免疫為主，其中具有免疫記憶功能和特異性殺傷作用這一從基因水平上證實(shí)腫瘤特異性抗原的存在。DC細(xì)胞具有免疫激活和誘導(dǎo)免疫耐受的生物學(xué)特性，在抗感染免疫、移植免疫、腫瘤免疫等方面意義重大。CIK細(xì)胞不是一種單一的細(xì)胞群，而是幾種細(xì)胞混合的異質(zhì)細(xì)胞群。作為一種新型、高效的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，CIK 細(xì)胞參與內(nèi)源性抗原的提呈，誘導(dǎo)對(duì)病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的殺傷和溶解，因而作為非限制性的免疫活性得到應(yīng)用。抗體參與的體液免疫不是抗腫瘤免疫的重要因素，有時(shí)甚至能促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。2006年世界衛(wèi)生組織(WHO)對(duì)外宣布，腫瘤生物治療(生物細(xì)胞免疫治療)有望徹底消滅腫瘤細(xì)胞，最終實(shí)現(xiàn)“帶瘤生存”的理想狀況。普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤是一種全身性疾病而不是局部病變，只是表現(xiàn)在局部某個(gè)臟器而已，多學(xué)科綜合治療已廣泛應(yīng)用于臨床，化療輔助中藥、微創(chuàng)及免疫治療是中晚期腫瘤治療的主要方法。

綜上所述，筆者認(rèn)為DC-CIK細(xì)胞可以降低Lewis肺癌細(xì)胞的存活率，促進(jìn)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡，這或許能為非小細(xì)胞肺癌的治療提供一個(gè)新的思路。但是前述結(jié)果是在體外實(shí)驗(yàn)中得到的，在動(dòng)物模型及人體中是否能夠取得同樣的結(jié)果還需要進(jìn)一步研究才能明確。此外，關(guān)于DC-CIK細(xì)胞降低Lewis肺癌細(xì)胞存活率并促進(jìn)其凋亡的具體機(jī)制尚不明確，有待于在今后的工作中深入研究。