去氧鬼臼毒素對人卵巢癌細胞SKOV3增殖的抑制作用

夏吾周毛 尕藏多杰 貢卻堅贊 林大勇 苗蘭英 張麗艷

(1青海大學藏醫學院，青海 西寧 810000；2青海省監獄管理局中心醫院；3遼寧中醫藥大學)

卵巢癌治療方案以手術配合術后化療為主，但其復發率較高，腫瘤容易出現耐藥性和遠處轉移，因此尋找有效治療卵巢癌的藥物一直是婦科腫瘤的研究熱點之一〔1〕。去氧鬼臼毒素(DPPT)是從小蘗科鬼臼屬植物華鬼臼中分離出的脂類結構的化合物，除了華鬼臼含有DPPT，其來源還包括中藥桃兒七和八角蓮等〔2〕。研究表明，DPPT具有治療病毒感染、抗腫瘤和抗白血病等多種藥理學活性，鬼臼的衍生物依托泊苷已經在臨床上用于治療乳腺癌和睪丸癌等生殖系統的腫瘤〔3，4〕。本研究在此基礎上通過在離體狀態下觀察DPPT對人卵巢癌細胞SKOV3增殖的影響，探討DPPT抑制卵巢癌細胞作用機制。

1 材料和方法

1.1材料和儀器 DPPT和噻唑藍(MTT)購于SIGMA-ALDRICH中國有限公司；人卵巢癌細胞SKOV3購于北京鼎國昌盛生物科技有限公司；DMEM培養液購于美國Gene公司；Hyclone小牛血清購于美國Thermo scientific公司；細胞外信號調節激酶(ERK)1/2多克隆抗體、β-actin購于武漢博士德生物工程有限公司；分析純試劑購于國藥集團北京分公司；低速離心機購于湖南赫西儀器裝備有限公司；CO2培養箱購于美國Thermo公司；550酶標儀和垂直系列電泳槽購于美國Bio-Rad公司。

1.2實驗分組 將人卵巢癌細胞SKOV3根據實驗目的不同分別接種于96孔板和6孔板內，待細胞貼壁后繼續培養至融合度90%左右，棄去培養基并加入不含血清的DMEM中，設置6個復孔：對照組中為無血清DMEM培養基；低濃度組為含濃度2.5 μmol/L DPPT的無血清DMEM培養基；中濃度組為含濃度5 μmol/L DPPT的無血清DMEM培養基；高濃度組為含濃度10 μmol/L DPPT的無血清DMEM培養基〔2〕。上述各組細胞分別在培養箱內孵育24 h和48 h后進行各項檢測。

1.3MTT法檢測各組細胞的增殖率 將接種于96孔板的細胞取出，棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，在每個孔中加入50 μl的含有MTT濃度為5 g/L的PBS溶液，室溫靜置4 h，棄去上清液，每孔中加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，在混勻儀上振動混勻1 h，使用550全自動酶標儀在570 nm下檢測光密度(OD)度值。計算細胞增殖率(%)=各孔OD值/對照組OD值均數×100%。

1.4蛋白質印跡法檢測ERK1/2蛋白的表達 使用蛋白裂解液將在6孔板內培養48 h和72 h的人卵巢癌細胞SKOV3裂解，將裂解產物收集到1.5 ml EP管中，煮沸5 min后通過高速離心機在12 000 r/min離心1 min。BCA法進行蛋白定量，向十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)中加入樣本，電泳分離后電轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。加入ERK1/2(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜后，加入二抗在37℃孵育30 min。采用凝膠成像分析系統，通過各條帶的吸光度值計算蛋白的相對表達量。

1.5統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞增殖率比較 低、中、高濃度DPPT組培養24 h、48 h后SKOV3細胞增殖率顯著低于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2各組ERK1/2蛋白相對表達量比較 低、中、高濃度DPPT組培養48 h、72 h ERK1/2蛋白相對表達量均顯著低于對照組(P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

表1 各組細胞增殖率比較

與對照組比：1)P<0.05，與低濃度DPPT組比較：2)P<0.05，與中濃度DPPT組比較：3)P<0.05，下表同

1～4：對照組、低濃度DPPT組、中濃度DPPT組、高濃度DPPT組；下圖同圖1 不同濃度DPPT培養48 h后ERK1/2蛋白相對表達量

圖2 不同濃度DPPT培養72 h后ERK1/2蛋白相對表達量

組別48 h72 h對照組3.17±0.253.79±0.14低濃度DPPT組2.25±0.181)2.23±0.331)中濃度DPPT組1.99±0.261)2)2.11±0.211)2)高濃度DPPT組1.76±0.111)2)3)1.99±0.211)2)3)

3 討 論

卵巢癌發病率和死亡率居高不下，嚴重威脅女性的生命安全〔5〕。在術后的化療方案中，主要以紫杉醇和順鉑為主，但由于化療的不良反應嚴重，而且卵巢癌極易產生耐藥性，因此尋找新的輔助治療藥物一直是女性腫瘤的研究熱點之一。藏醫學是祖國傳統醫學之一，作為《四部醫典》的藏醫學基礎理論書籍對鬼臼有明確記載，其用于治療毒蛇咬傷和癰癤腫毒。鬼臼是一種芳基萘內酯類，毒副作用較強，不易溶于水，這些因素制約了鬼臼的臨床應用〔4,6〕。在將其母核改造后于20世紀五十年代生產出商品藥物依托泊苷和替尼泊苷。由于其母核中的C環4位的O較為活躍，因此對鬼臼的研究主要是圍繞改造4位的O進行的〔4,7〕。本實驗中使用的DPPT，在去除了O后，化學性質較為穩定，而且抗腫瘤活性明顯增強，即在攝入低劑量的DPPT時就可以明顯的產生抑制腫瘤生長的作用，毒副作用小。鬼臼的藥理學活性廣泛，具有抗病毒和抗腫瘤的作用。研究顯示鬼臼可以抑制肺癌、睪丸癌、乳腺癌淋巴癌和白血病等惡性腫瘤的增殖，其作用機制與調控腫瘤細胞含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、p53、Bcl-2 和基質金屬蛋白酶(MMP)9 的表達有關，但對于卵巢癌的作用報道較少，作用機制不明〔8～10〕。

在1990年，ERK被首次描述為絲氨酸/蘇氨酸激酶參與各種細胞的調節反應，他是調控細胞增殖、分化和抑制凋亡的重要信號通路之一，可以被多種細胞外信號所如生長因子等活化〔11〕。研究顯示，活化的ERK1/2信號通路對于細胞增殖具有明確的促進作用，ERK1/2能夠上調磷酸化(p)-ERK1/2的表達水平從而進一步降低細胞凋亡率。在對肺癌NCI-H358增殖的研究過程中發現DPPT可以通過調節ERK1/2信號通路對肺癌細胞的增殖和分化進行調控〔2〕。本研究說明DPPT可以有效抑制SKOV3細胞的增殖，而且呈現出時間和計量的依賴性。

綜上所述，DPPT可以有效地抑制人卵巢癌細胞SKOV3的增殖，其作用機制與抑制ERK1/2蛋白的表達相關。