堿性成纖維細胞生長因子對心臟缺血再灌注損傷的治療作用

楊梅

(濟南市第三人民醫(yī)院重癥醫(yī)學科，山東 濟南 250132)

急性心肌梗死(AMI)的首要治療原則是及時恢復冠狀動脈供血，縮小心臟梗死面積。因此，臨床上以經皮冠狀動脈介入治療(PCI)和冠狀動脈旁路移植術(CABG)為常用的治療方式〔1〕。然而，缺血再灌注后常會引起心肌細胞代謝功能異常、活性氧自由基釋放、炎性因子和炎性細胞活化等一系列病理生理改變，最終導致心臟缺血病變更加嚴重，即心臟缺血再灌注損傷(MIRI)〔2～4〕。目前認為，心肌細胞凋亡和炎性介質活化在MIRI的病理過程中發(fā)揮著至關重要的作用。因此，研究可以阻斷心肌細胞凋亡和炎性介質活化的藥物具有重要意義〔5，6〕。大量研究發(fā)現(xiàn)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)在各種損傷中發(fā)揮抗炎、拮抗活性氧自由基、促進血管生成、刺激組織細胞分裂等作用，被廣泛運用于血管、神經、肺、子宮等組織器官的再生〔7～9〕。但是，bFGF在MIRI中是否發(fā)揮保護作用及其具體機制仍然缺乏深入的研究。因此，本文擬探討bFGF對MIRI的治療效應及其作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 30只健康清潔的普通級雄性SD大鼠，體重250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司；bFGF、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自Sigma公司；一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。

1.2心臟缺血再灌注損傷大鼠模型的構建 采用隨機數(shù)字表法將30只SD大鼠隨機分成正常對照組(Control)、MIRI組、MIRI后bFGF治療組(MIRI+bFGF組)，每組10只。SD大鼠腹腔注射1 ml的10%水合氯醛進行麻醉，氣管插管后連接小動物呼吸機進行輔助呼吸，對左側胸部第4、5肋間的手術區(qū)進行備皮、消毒，隨后依次剪開皮膚、鈍性分離肌肉、暴露心臟、分離心包膜，于左心耳下3 mm以活結結扎冠狀動脈左前降支，當左心室壁的顏色由紅色轉變?yōu)榘咨C明結扎成功，隨后關閉胸腔，30 min后重新打開胸腔剪開結扎處進行再灌注，最后再次關閉胸腔〔10，11〕。Control組除不結扎外其他手術操作同上；MIRI+bFGF組在MIRI造模后，立即以5 nmol/kg的劑量于尾靜脈注射bFGF。

1.3心功能檢測 于術后72 h，使用vevo2100小動物超聲影像系統(tǒng)對各組大鼠進行心功能評價，主要檢測左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(FS)和每搏輸出量(SV)。

1.4血清心肌酶譜的檢測 10%的水合氯醛麻醉大鼠后，開腹后經腹主動脈取血，將采集的血液標本室溫靜置片刻后以2 000 r/min 4℃離心10 min，取血清于全自動生化檢測儀分析血清心肌酶譜的含量，包括肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)。

1.5TTC溶液染色法檢測心肌梗死面積 取血后，開胸將心臟分離，擦干血跡后，于結扎處以下以2 mm的厚度切片，切片置于1% TTC溶液中37℃孵育20 min，紅色染色區(qū)為有活力的心肌組織，灰白色染色區(qū)為梗死的心肌組織，拍照后采用Image Pro Plus 6.0軟件分析心肌梗死面積，心肌梗死面積(%)=灰白色區(qū)域面積/紅色區(qū)域面積×100%。

1.6心肌細胞凋亡檢測 使用一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒分析心肌細胞的凋亡情況，將心臟組織用4%多聚甲醛浸泡固定，30%蔗糖溶液脫水，隨后將組織塊用OCT包埋劑包埋，于液氮中速凍，使用冰凍切片機將樣品組織切成厚度為8 μm的冰凍切片，最后將切片保存于-80℃超低溫冰箱。將切片室溫平衡30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后用含0.5% Triton X-100的PBS室溫孵育5 min，洗滌后用TUNEL檢測液37℃避光孵育60 min，洗滌后用DAPI染色液染核，洗滌、封片后在熒光顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡情況。

1.7血清炎性因子的檢測 使用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清中炎性因子的表達量，包括IL-1β、IL-6和TNF-α。

1.8統(tǒng)計學分析 使用SPSS20.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析，若有顯著性差異(P<0.05)再進行組間的兩兩比較。

2 結 果

2.1bFGF對MIRI大鼠心功能的影響 與Control組比較，MIRI組LVEF、FS和SV均明顯降低(P<0.05)，表明成功構建了MIRI大鼠模型。與MIRI組比較，MIRI+bFGF組心功能顯著改善，且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，表明MIRI后尾靜脈注射bFGF可改善大鼠的心功能，從而發(fā)揮保護作用。見表1。

表1 各組心功能比較

與Control組相比:1)P<0.05；與MIRI組相比:2)P<0.05；下表同

2.2bFGF對MIRI后大鼠血清心肌酶譜的影響 與Control組比較，MIRI組CK和LDH水平顯著增高(P<0.05)，表明MIRI后，CK和LDH從含量豐富的心肌細胞中釋放至血清中；而與MIRI組比較，MIRI+bFGF組這兩項指標均顯著改善(P<0.05)。見表2。

2.3bFGF對MIRI后心肌梗死面積的影響 與Control組(0%)相比較，MIRI組梗死面積〔(29.37±4.12)%〕明顯增大(P<0.05)，而bFGF治療組使得梗死面積顯著降低〔(16.65±3.49)%，P<0.05〕。

2.4bFGF對MIRI后心肌細胞凋亡率的影響 MIRI后，心肌細胞的凋亡率〔(21.33±2.40)%〕顯著增高(Control組為0%，P<0.05)，而bFGF治療可顯著降低心肌凋亡率〔(10.64±1.52)%，P<0.05〕。

2.5bFGF對MIRI后血清炎性因子的影響 與Control組比較，MIRI組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著增高(P<0.05)，而bFGF治療則顯著降低了損傷后炎性因子的表達(P<0.05)，見表3。

表2 各組大鼠血清心肌酶譜的比較

表3 各組血清炎性因子水平比較

3 討 論

缺血性心肌病是威脅中老年人健康的常見疾病，目前臨床上主要的治療方法是盡早恢復冠狀動脈的血液供應。然而，恢復供血的同時可能會造成缺血心肌組織的二次損傷，引起MIRI〔12，13〕。因此，探討如何治療MIRI及其機制具有重要的臨床應用價值。bFGF又稱成纖維細胞生長因子(FGF)-2，因可促進成纖維細胞的生長增殖而得名，同時其具有促進細胞生存、遷移、分化等廣泛的生物學作用，因此常被應用于皮膚、神經、骨、肺等組織的損傷修復〔14，15〕。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，對心絞痛患者進行bFGF治療可以促進血管內皮細胞的生長增殖，從而顯著降低了患者心絞痛的發(fā)生率〔16〕。本實驗成功構建了MIRI大鼠模型，并且研究發(fā)現(xiàn)，bFGF治療可以顯著改善造模大鼠的心功能，降低血清心肌酶譜和心肌梗死面積，表明bFGF通過大鼠尾靜脈注射后，可迅速隨血液循環(huán)至受損的心肌組織，從而發(fā)揮保護作用。而且，bFGF可能通過抗凋亡和抗炎等綜合因素保護受損的心肌組織〔10，17，18〕。綜上所述，本文為bFGF在MIRI中的應用提供了研究基礎，并從抗凋亡和抗炎兩個方面探討了bFGF的作用機制。盡管如此，本文仍有許多問題尚待解決，如bFGF靜脈注射后的組織器官分布、bFGF是否具有副作用及用藥劑量等，因此我們將開展進一步研究，爭取早日實現(xiàn)bFGF在MIRI患者中的臨床應用。