Cx43 基因修飾對大腸癌細胞的放射增敏作用

王炳杰 胡延偉 趙葉芳 張仕東

(河北醫科大學附屬邢臺市人民醫院 1肛腸外科，河北 邢臺 054001；2普外科；3婦產科)

西醫上大腸癌的傳統治療手段除手術外，還有副作用較明顯的放療、化療等方法及免疫和內分泌的輔助治療〔1～3〕，對于中、晚期患者來說，這些手段確實可以緩控病情，改善患者生存情況〔4,5〕，但仍然不能改變大腸癌的高死亡率的現象〔6,7〕。20世紀九十年代初，基因治療已進入新的研究領域，已從基礎實驗室研究邁向臨床研究，為遺傳性疾病、免疫缺陷及惡性腫瘤提供了新的研究手段〔8,9〕，同時還可以通過提高癌細胞的放射增敏性來改善西醫放療的效果〔10〕。即癌細胞受到低于平常劑量的放射劑刺激而死亡，正常細胞受到的射線輻射較小，減少了不良反應的發生〔11〕。細胞之間的生命活動及信號傳導是通過縫隙連接建立的〔12〕，縫隙連接有自身獨特的信號因子構成縫隙連接的細胞通訊。細胞通訊的異常，往往會導致細胞病變，嚴重的即形成癌細胞〔13〕。連接子蛋白(Cx)的構成多聚體，并聚集于細胞膜上，形成連接子，即縫隙連接的基本單位。相鄰的連接子蛋白多聚體相互嵌合形成縫隙連接〔14〕。Cx43蛋白是眾多連接子蛋白之一，對相鄰細胞間的連接和通訊起到重要作用，誘導癌細胞表明的Cx 43蛋白表達可建立正常細胞縫隙連接，抑制癌細胞增殖〔15,16〕。本實驗通過質粒pBudCE4.1，將Cx43基因轉染至大腸癌SW480細胞，探討轉染Cx43基因對大腸癌SW480細胞放射增敏性的影響。

1 材料與方法

1.1設計 隨機對照動物實驗。

1.2時間及地點 實驗于2013年3月至2015年10月在河北醫科大學動物實驗中心完成。

1.3實驗動物及分組 成年健康級BALB/C裸鼠30只，性別不限，由河北醫科大學動物實驗中心提供，體重約300 g，依照隨機數字表，分為3組：轉染組、陰性對照組和空白組。所有大鼠的飼養條件為：23～27℃，恒溫，濕度為50%～70%，喂養飼料：顆粒型普通大鼠飼料及消毒無菌水，讓其自由飲水和進食，實驗前1 d禁食不禁水。

1.4實驗細胞及主要材料 大腸癌細胞株SW480細胞購自河北生命科學研究院，由本實驗室冷凍保存，載體pBudCE4.1購于Novagen公司，RT-PCR試劑盒購于TaKaRa公司，L-DMEM培養基、胎牛血清購自GIBCO公司，Cx43抗體購于Proteintech公司，GAPDH抗體購于Bioworld公司，二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體)購自優維寧生物技術公司，熒光黃燃料和羅丹明染料購于濟南龍盛，姬姆薩酚購于美國Sigma公司。原位細胞凋亡檢測(TUNEL)購于貝克曼庫爾特公司，細胞培養皿、細胞培養瓶購于上海百研生物科技有限公司，二氧化碳培養箱購于上海人和科技有限公司，熒光顯微鏡購于上海儀器廠，DNA engine opticon PCR 儀購于MJ Research，USA。

1.5方法

1.5.1通過pBudCE4.1-Cx43轉染入大腸癌SW480細胞 將大腸癌SW480細胞分為轉染組、陰性對照組和空白組。參考Genebank及pBudCE4.1限制性內切酶序列和Cx43引物的序列，由河北生物工程技術有限公司合成引物〔17〕。引物序列為：Cx43的基因序列為5′-AGAGCACGGCAAGGTGAAA-3′，陰性對照物Scrambled的基因序列5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′〔18〕。依據轉染試劑盒說明書的要求，在轉染試劑Lipofectamine 2000下進行轉染。接種大腸癌SW480細胞于兩塊6孔培養板中(轉染組和陰性對照組)，密度為3×105個/孔，加入不含血清和抗生素的新鮮培養液，培養24 h〔19〕。合成復合物的條件為：轉染組為5 μl的pBudCE4.1-Cx43溶液、5 μl的Lipofectamine 2000轉染試劑和2 ml的新鮮培養基；陰性對照組為5 μl的Scram bled 溶液、5 μl的Lipofectamine 2000轉染試劑和2 ml的新鮮培養基，6 h后更換新鮮培養基。轉染組和陰性對照組均多次轉染，培養48 h后進行實驗〔20〕。

1.5.2RT-PCR檢測Cx43 mRNA的表達情況 總RNA從轉染48 h后的大腸癌SW480細胞中提取，按說明書進行提取總RNA并以總RNA的mRNA為模板，參照說明書的逆轉錄酶法反轉錄合成cDNA，在擴增儀上進行RT-PCR。吸取2 μl的懸浮細胞液，正反向引物各加入1 μl懸浮細胞液。Cx43的上游引物為：5′-AAAGGCGTTAAGGATCGCGTG-3′，下游引物為：5′-GTCATCAGGCCGAGGCCT-3′，擴增目的基因片段長度為209 bp。內參物β-actin的上游序列為：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游序列為：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增目的基因片段長度為127 bp〔21〕。Cx43反應循環條件如下：94℃變性2 min，94℃ 45 s，58℃退火45 s，72℃ 90 s，32循環，最終72℃延伸5 min。β-actin的反應循環條件為：94℃變性2 min，94℃ 30 s，56℃退火30 s，72℃ 90 s，28個循環，最終72℃延伸5 min。將PCR產物10 μl于1.2%瓊脂糖凝膠電泳30 min，采用凝膠自動成像及分析系統，電泳結果用凝膠圖像分析系統分析電泳條帶光密度值，計算Cx43與β-actin光密度光比值，各組實驗均需重復3次。

1.5.3Western印跡檢測Cx43蛋白的表達情況 收集被轉染48 h的大腸癌SW480細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液洗滌3次，加入100 μl細胞裂解液(預先冰浴10 min)，用(BCA)法測定細胞中的蛋白含量，擬合蛋白標準曲線，計算其上樣量〔22〕。4%十二烷基硫化硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，15 mA電泳1 h后，取下凝膠，蛋白條帶電轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，將轉移完成的PVDF膜放入培養皿，加入5%脫脂奶粉，浸過PVDF膜即可，封閉1 h。與多克隆兔抗體Cx43(1∶250)反應，陰性對照組與GAPDH(1∶1 000)抗體反應。一抗稀釋后放入培養皿中，加入PVDF膜，4℃恒溫過夜，過夜振蕩孵育后，取出PVDF膜，用TBST液沖洗多次，每次浸潤5 min。與二抗反應，常溫下振蕩孵育2 h，取出PVDF膜，用TBS液沖洗多次，每次浸潤5 min。按照電化學發光(ECL)說明書的操作步驟，對PVDF膜進行熒光染色，液體A和液體B等量混合后，將其加入PVDF膜正面，反應1 min，置于暗室10 min，曝光、顯影、定影，通過Alpha2200圖像分析儀對各組條帶掃描拍照，并對其光密度值進行半定量分析〔23,24〕。

1.5.4劃痕染料示蹤法檢測細胞間通訊功能 預先分別將50 mg熒光黃粉末、50 mg羅丹明染料溶于2 ml無水乙醇中，加熱超聲充分溶解后，并用1 ml PBS液稀釋，分別配置0.05%的熒光黃溶液和0.05%的羅丹明染劑。收集被轉染48 h的大腸癌SW480細胞及陰性對照組細胞，分別放置于培養皿，用PBS溶液洗滌3次，37℃下，加入熒光黃溶液和羅丹明染劑各1 ml，用手術刀在在培養皿中劃痕，靜止5 min，除去染料，用PBS溶液洗滌3次，2%多聚甲醛固定0.5 h，室溫下自然烘干。熒光顯微鏡下，每切片隨機選取10個視野，觀察轉染組和陰性對照組的細胞通訊情況，并用Image J對轉染組和陰性對照組的細胞情況進行分析。

1.5.5通過6 MV X射線照射后采用集落形成實驗檢測細胞放射敏感性 收集被轉染48 h后的轉染組和同時期的陰性對照組大腸癌SW480細胞，分別放置于培養板中，并將培養板倒扣于5 mm厚的補償膜上，X射線進行照射，照射條件為：37℃，6 MV X射線，源皮距100 cm，劑量率為140 cGy。照射完成后，將細胞于培養板中培養10 d，棄掉培養液，用PBS溶液浸洗多次，用甲醇溶液固定0.5 h，倒掉固定液，滴入姬姆薩染液染色0.5 h，用蒸餾水多洗浸洗，室溫下自然烘干。倒置培養板，并放置網格透明片，按照細胞數大于50為1個克隆計數進行計數克隆。采用數學模型進行數據擬合，計算Do和Dq的數值，比較被轉染48 h后的轉染組和同時期的陰性對照組細胞的放射敏感性〔25〕。

1.5.6流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率 轉染48 h后，收集轉染組和陰性對照組的大腸癌SW480細胞，10 Gy照射。37℃下，兩組細胞用的胰蛋白酶(濃度為0.25%)進行消化，1 500 r/min，離心10 min，去上清液，用已配置好的PBS溶液洗滌3次，重懸細胞濃度為1×106/ml。用移液槍移取100 μl的細胞于流式管中，緩慢加入低溫細胞固定液即AnnexinV-FITC溶液，4℃下充分振蕩，并在4℃下靜置24 h。離心10 min，1 000 r/min后，除去細胞固定液，PBS溶液洗滌多次，轉染組和陰性對照組分別加入100 μl，200 μg/ml的RNA酶溶液，室溫下，靜置1 h后，加入染色液50 μg/ml的PI溶液和，進行染色，0.5 h后加入PBS溶液，流式細胞儀被用來測定轉染組、陰性對照組的大腸癌SW480細胞，用Light cycel 分析軟件分析細胞周期的分布，比較轉染組和陰性對照組的大腸癌SW480細胞的凋亡情況。

1.5.7觀察10 Gy照射后腫瘤生長狀況及Bcl-2基因活性 通過皮下接種的方法構建人大腸癌裸鼠移植瘤模型，給予10 Gy進行照射，通過測定腫瘤大小的方法，來判斷照射后腫瘤的生長狀況。應用比色法通過添加特異性底物來測定Bcl-2基因活性。對細胞進行觀察，待貼壁后將其放入有放射線的環境中過夜。次日將其拿出，向其中添加胰酶對其進行消化，隨后進行離心，并將待測細胞進行收集，將細胞進行重懸處理，并進行沖洗。向其中添加裂解液再次重懸細胞，隨后將其放于冰上，10 min再次向其中添加裂解液，并進行離心，將其上清取出，放入緩沖液中測定其活性。向其中添加Bcl-2的底物并進行溫育，1 h后應用分光光度計測定其吸光值。通過比較轉染組和空白組的吸光度值來檢測其活性變化。

1.6統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗及方差分析。

2 結 果

2.1RT-PCR檢測Cx43 mRNA的表達情況 與空白組mRNA表達水平(0.93±0.11)相比，陰性對照組Cx43 mRNA表達水平(0.97±0.13)增高，轉染了Cx43基因的48 h后轉染組的大腸癌SW480細胞中的Cx43 mRNA表達(1.82±0.21)明顯高于陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2Western印跡檢測Cx43蛋白的表達情況 轉染了Cx43基因48 h后的轉染組大腸癌SW480細胞中Cx43蛋白表達(2.06±0.26)與陰性對照組(1.01±0.15)相比較高，差異有統計學意義(P<0.05)，空白組Cx43蛋白水平(0.98±0.11)最低。Western印跡檢測的蛋白表達水平結果印證了與RT-PCR法檢測的mRNA表達結果，見圖2。

圖1 各組Cx43 mRNA表達水平

圖2 各組Cx43蛋白表達水平

2.3劃痕染料示蹤法檢測細胞間通訊功能 劃痕染料示蹤法檢測細胞間通訊功能轉染組()明顯升高；細胞顯微鏡觀察各組細胞的染料傳遞量，統計分析實驗組細胞間染料傳遞2～3層間，明顯比空白組(-)和陰性對照組(1)間的傳遞量高，染料局限于劃痕邊緣的單層細胞為未傳遞(-) ,1～2層細胞有染料為(+) ,2～3層細胞有染料為()，故差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4細胞放射敏感性 轉染組與陰性對照組和空白組相比，經過射線放射處理后，細胞的增殖能力顯著降低(P<0.05)，可以看出轉染組的Do和Dq值小于陰性對照組和空白組，空白組的Do和Dq值最高。因此三組的放射敏感性為轉染組最強，陰性對照組次之，空白組的放射敏感性最弱，見表1。

表1 轉染組、陰性對照組和空白組的Do和Dq參數比較

與轉染組比較：1)P<0.05；與陰性對照組比較：2)P<0.05

2.5細胞的凋亡率 轉染組細胞凋亡率〔(19.86±1.53)%〕明顯高于陰性對照組〔(6.75±1.20)%〕和空白組〔(6.90±1.17)%〕，差異有統計學意義(P<0.05)，而陰性對照組和空白組凋亡率類似，因此可以推測Cx43基因可以促進癌細胞的凋亡。

2.6觀察10 Gy照射后腫瘤生長狀況及Bcl-2基因活性 對人大腸癌裸鼠移植瘤模型給予10 Gy進行照射，通過測量腫瘤的大小發現，轉染組〔(5.40±0.56)mm3〕較陰性對照組〔(9.62±0.52)mm3〕和空白組〔(10.12±0.63)mm3〕的腫瘤明顯減小，表明經照射后移植瘤生長受到顯著的抑制作(P<0.05)；Bcl-2基因表達活性，轉染組〔(15.40±2.23)%〕較陰性對照組〔(59.47±4.52)%〕和空白組〔(62.12±5.48)%〕明顯降低(P<0.05)。

3 討 論

縫隙連接的細胞間通信信號傳導，是維持機體細胞的生態平衡、細胞分裂分化的重要保障〔26～28〕。異常的縫隙連接將會導致細胞癌變，癌變后的細胞可在血管內皮細胞自由游走，可進入淋巴管、血管〔29〕，為癌癥轉移提供了條件〔30〕。已有研究證實編碼質量數為43 kD，由387個氨基酸組成的Cx43是縫隙連接的重要連接蛋白〔28〕，其主要功能是在細胞膜上形成小分子物質的通道，調節細胞活動〔31〕。研究者發現，諸多癌癥的轉移都與Cx43表達缺失相關。研究發現，細胞間縫隙連接相對較好的癌細胞，轉移能力明顯低于縫隙連接相對較差的腫瘤細胞，癌細胞轉移受到腫瘤細胞間縫隙連接的影響〔32，33〕。也有研究者發現，正常細胞的Cx43蛋白表達水平很高，Cx43蛋白表達于腫瘤細胞的轉移密切相關，且Cx43蛋白表達與腫瘤細胞轉移能力呈反比，即Cx43蛋白表達水平越高，腫瘤細胞轉移越弱〔34〕。大腸癌細胞SW620細胞株表明同樣發現了低表達水平的Cx43蛋白〔35〕。因此可以大膽設想，對大腸癌細胞增加Cx43蛋白的表達，對癌癥的惡化有可能起到延緩作用。在癌細胞中，檢測Bcl-2基因可反映細胞的凋亡情況〔36，37〕，Bcl-2基因是一種原癌基因，其蛋白表達水平越低，則癌細胞惡化越嚴重〔38～40〕。對直腸癌采用西醫放療方法治療，會伴有嚴重的消化道出血、穿孔等副作用，不僅使患者疼痛難忍，同時也對正常細胞組織造成了一定的損害〔41〕。因此，提高放射的增敏性，減少放射劑量的使用，已成為腫瘤研究者的關注點。

依據本研究可以推測轉染Cx43基因在大腸癌細胞SW480中可以得到很好表達，為遏制大腸癌細胞的轉移提供了條件。Cx43基因可以增大癌細胞的放射增敏性。Cx43基因可以在一定程度上促進細胞的凋亡。Cx43蛋白的高水平表達進而建立了縫隙連接相關。大腸癌細胞SW480中Bcl-2基因表達同樣受到Cx43基因的影響，因此大腸癌細胞的惡化程度最低，由此可推測Cx43基因有可能就是通過Bcl-2表達來發揮作用的。因此，轉染Cx43基因能在大腸癌SW480細胞得到很好的表達，能夠提高人大腸癌SW480細胞對X射線的敏感性，遏制腫瘤細胞轉移，機制有可能是降低了細胞Bcl-2基因表達。