獨活寄生湯抑制白細胞介素-1β誘導的軟骨細胞凋亡的作用機制

林燕云 游純秋 蔣擎 吳盛紅

(福州市中醫院，福建 福州 350001)

骨關節炎(OA)是一種常見的慢性、進行性關節疾病〔1,2〕。OA患者關節軟骨細胞凋亡率明顯高于正常關節〔3,4〕。因此，如何抑制軟骨細胞凋亡可能是一種有效治療OA的途徑。獨活寄生湯作為一種治療肝腎虧虛型痹證的經典古方，臨床上廣泛應用于OA的治療，但其作用機制尚不清楚〔5～7〕。miRNA(miR)是一種短鏈非編碼RNA，能夠調節軟骨細胞增殖、分化、衰老、凋亡等生物學行為，在OA的發生發展過程中起著重要作用。miR-98的過表達能夠促進軟骨細胞凋亡〔8〕。本研究旨在探討獨活寄生湯對白細胞介素(IL)-1β誘導的軟骨細胞凋亡模型的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑與儀器 4周齡SPF級雄性SD大鼠8只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2012-0002。獨活寄生湯中的處方藥材購自福建中醫藥大學附屬福州市中醫院；Collagen Ⅱ、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、β-actin抗體購自美國Abcam公司；Bcl-2相關X蛋白(Bax)、Caspase-3、Caspase-9抗體購自美國CST公司；噻唑藍(MTT)、IL-1β購自美國Sigma公司；放射免疫沉淀測定(RIPA)裂解液(強)及二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天生物技術有限公司；光學顯微鏡購自德國LEICA公司；LX-800酶標儀購自美國Bio-teK公司；熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；內參U 6引物、miR-98引物、miRNA提取試劑盒購自美國Taqman公司。

1.2獨活寄生湯制備 根據處方量稱取藥材，置于3 L的圓底燒瓶中，加入10倍量體積的水，加熱回流提取2次，每次2 h，過濾后合并濾液，旋轉薄膜蒸發儀對濾液進行濃縮，低溫真空烘箱烘成浸膏備用。

1.3軟骨細胞的分離、培養和鑒定 8只SPF級SD大鼠，10%水合氯醛麻醉處死，無菌條件下刮取股骨髁及脛骨平臺的關節軟骨，置于無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，手術刀切成1 mm3的塊狀，加入4 ml 0.2% Ⅱ型膠原酶，置于培養箱進行消化，每2 h收集一次上清液并1 000 r/min離心3 min，棄掉上清液，加入含10%胎牛血清(FBS)的改良的Eagle培養基(DMEM)培養液重懸，并接種于25 mm2培養瓶中，重復3～5次至組織塊消化完全，此時的細胞標記為原代細胞，隔天換液一次。將生長狀態良好的第二代軟骨細胞接種于含有細胞爬片的6孔板中，隨機分為陽性組、陰性對照組，冰甲醇固定30 min，PBS洗滌3次，3%H2O2處理20 min，PBS洗滌3次，5%BSA室溫封閉1 h，陽性組4℃下過夜孵育一抗CollagenⅡ，陰性對照組不進行一抗CollagenⅡ孵育，PBS洗3次，二抗37℃孵育1 h，PBS洗滌3次，二氨基聯苯胺(DAB)顯色5 min，自來水漂洗，蘇木素復染15 s后，晾干，封片，顯微鏡下觀察。

1.4MTT法優化獨活寄生湯干預濃度 將第2代軟骨細胞以1×105個/ml接種96孔板中(每孔100 μl)，48 h后洗掉培養液，分別以0，100，200，300，400 μg/ml獨活寄生湯干預由10 ng/ml IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡模型，每個濃度設置6個復孔。培養48 h，棄掉培養液，加入濃度為0.1%的MTT 100 μl，置于培養箱內4 h，棄掉MTT，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，充分震蕩后，酶標儀490 nm波長測定其吸光度，求平均值。

1.5軟骨細胞的分組和干預 將生長良好的第二代關節軟骨細胞以1×105個/ml接種于6孔板中(每孔2 ml)，隨機分為空白組、模型組、獨活寄生湯組，其中空白組以含10% FBS的DMEM培養液培養，模型組以10 ng/ml IL-1β和10% FBS的DMEM培養液培養，獨活寄生湯組采用300 μg/ml獨活寄生湯、10 ng/ml IL-1β和10% FBS的DMEM培養液培養，3組連續干預48 h。

1.6逆轉錄PCR檢測各組軟骨細胞中miR-98的表達 細胞用PBS洗滌3次，每孔加入600 μl裂解/結合緩沖液裂解液，根據提取試劑盒說明書提取總miR，定量后取50 ng根據逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄。按Applied Biosystems Universal Master Mix 試劑盒說明書進行加樣，使用Fast 7500熒光定量儀進行熒光收集，采用2-ΔΔCt法計算各組間的基因表達水平。

1.7Western印跡法檢測各組軟骨細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達 細胞用PBS洗滌3次，每孔加入80 μl蛋白裂解液，冰面上裂解30 min后，收集裂解物并轉移至1.5 mL EP管中，4℃下14 000 r/min 離心30 min，輕輕吸取上清液獲得總蛋白。根據BCA蛋白定量結果，取25 μg總蛋白進行上樣，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳至目的蛋白分開，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉膜完成后Tris-Hcl緩沖液(TBST)洗滌3次，封閉液室溫封閉1 h，TBST洗滌3次，4℃下孵育相對應的一抗，TBST洗滌3次，室溫下孵育二抗1 h，儀器上進行曝光、顯影。采用Image Lab 圖像處理軟件對目的條帶進行分析，求算條帶灰度值。

1.8統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1Ⅱ型膠原免疫組化鑒定關節軟骨細胞 陽性組軟骨細胞胞質被染成棕黃色，而陰性對照組軟骨細胞未見棕黃色，所培養的第二代關節軟骨細胞具有典型的軟骨細胞生物學特征。見圖1。

圖1 軟骨細胞的Ⅱ型膠原免疫組化鑒定(×100)

2.2各組軟骨細胞活性 藥物干預48 h后，空白組軟骨細胞活性(1.00±0.00)顯著高于模型組(0.45±0.03)，差異有統計學意義(P<0.05)。獨活寄生湯(100、200、300、400 μg/ml)組軟骨細胞活性分別為(0.47±0.02)、(0.48±0.02)、(0.54±0.04)、(0.51±0.03)，其中300、400 μg/ml獨活寄生湯組細胞活性顯著高于模型組(P<0.05，P<0.01)。

2.3各組軟骨細胞中miR-98的表達 與空白組(1.00±0.00)比較，模型組軟骨細胞中miR-98表達(3.18±0.48)明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，獨活寄生湯組軟骨細胞中miR-98表達(1.80±0.43)明顯下降(P<0.01)。

2.4各組軟骨細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達 與空白組比較，模型組軟骨細胞中Bcl-2蛋白表達明顯下降(P<0.05)，而Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，獨活寄生湯組軟骨細胞Bcl-2蛋白表達明顯上升，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達明顯下降(P<0.05,P<0.01)，見圖2、表1。

圖2 各組軟骨細胞中相關蛋白的表達

組別BaxBcl-2Caspase-3Caspase-9空白組0.16±0.010.78±0.050.14±0.010.58±0.09模型組0.29±0.031)0.64±0.211)0.31±0.021)1.00±0.161)獨活寄生湯組0.19±0.023)0.76±0.020.20±0.033)0.76±0.122)

與空白組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01

3 討 論

從中醫學角度來看，OA屬于“痹證”范疇，常發病于中老年人群，主要病因病機為肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養。獨活寄生湯具有益肝腎、補氣血、祛風濕、止痹痛功效，在治療OA方面效果顯著，且不良反應小、適合長期用藥。

成功地體外分離培養軟骨細胞是體外研究OA的前提。Ⅱ型膠原屬于軟骨細胞特征性分泌基質，對維持軟骨細胞的結構和功能有著重要的作用。Ⅱ型膠原免疫組化染色結果顯示所分離培養細胞胞質中Ⅱ型膠原表達豐富，具有典型的軟骨細胞生物學特征。軟骨細胞異常凋亡是引起OA一個重要原因〔9〕。OA軟骨細胞數量的減少、軟骨厚度變薄及表型的改變與軟骨細胞的凋亡息息相關。軟骨細胞的凋亡增加，能促進軟骨基質的降解，減少基質合成〔10〕。IL-1β的表達水平與關節軟骨退變程度呈正比例關系，是破壞關節軟骨最直接的細胞因子，能夠抑制軟骨細胞蛋白聚糖、Ⅱ型膠原的合成，促進軟骨基質的降解，同時也能誘導軟骨細胞的凋亡。Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9均是細胞凋亡的重要調控因子。Caspase作為軟骨細胞凋亡的重要執行者，如Caspase-9活化時，能夠激活Caspase-3，其可降解多種蛋白底物，引發Caspase級聯反應導致軟骨細胞凋亡〔11〕。Bcl-2具有抑制多種因素引起軟骨細胞凋亡的作用〔12〕。而Bax與Bcl-2相互拮抗，當Bcl-2高表達時能形成Bcl-2同源二聚體起到抑制軟骨細胞凋亡的作用；Bax高表達時，促進異源二聚體形成，抑制Bcl-2抗凋亡功能，同時也能夠促進形成Bax同源二聚體，引發Caspase介導的軟骨細胞凋亡〔13〕。本研究提示獨活寄生湯具有抑制軟骨細胞凋亡的作用。miR屬于一種單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，在逆轉錄后可調控相關基因表達從而影響蛋白的翻譯，在機體各種生理與病理狀態中起著重要的調節作用〔14〕。miR-98能下調軟骨細胞Bcl-2表達，促進軟骨細胞凋亡〔15〕。

綜上，獨活寄生湯可促進軟骨細胞活性的增加，下調軟骨細胞中miR-98的表達，可能是通過Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9靶點起作用的，但由于獨活寄生湯組分多且成分復雜，有待進一步研究。