低分子肝素對膿毒癥大鼠肺血管內皮細胞的保護作用

田培剛 李建華 程青虹

(石河子大學醫學院第一附屬醫院重癥醫學二科，新疆 石河子 832000)

膿毒癥主因全身炎癥紊亂失衡而導致的進行性內皮功能障礙，白細胞及血小板激活，抗凝/促凝系統紊亂，最后常引起多器官功能障礙綜合征(MODS)〔1〕。有一半的嚴重膿毒癥患者會并發急性肺損傷，而受累器官功能障礙是膿毒癥最常見的致命并發癥之一〔2,3〕，而這首當其沖的器官常常是肺臟。低分子肝素不但具有較強的抗凝血作用，還具有抗炎、免疫調節和保護血管內皮細胞(VEC)的功能〔4,5〕。本實驗采用盲腸結扎穿孔術(CLP)復制大鼠膿毒癥模型，并給予低分子肝素干預治療，通過觀察低分子肝素對膿毒癥大鼠肺VEC功能的影響，探討其發揮保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 實驗動物購自新疆醫科大學動物實驗中心。健康雄性成年SPF級SD大鼠90只，體重(270±20)g，在溫度(20±2)℃，濕度50%±20%的條件下，適應性飼養1 w，給予15 g左右的鼠糧和足量飲水，實驗前禁食不禁水 12 h。所有動物實驗得到石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會的審查同意，實驗過程都嚴格遵循實驗動物的護理和使用指南。

1.2實驗試劑及儀器 低分子肝素鈉注射液(0.4 ml:4000Axa IU)，賽諾菲(北京)制藥有限公司；HE染色試劑盒和即用型免疫組織化學試劑盒，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司； Hoechst 33258染色液(即用型)，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3動物分組及處理因素 90只SPF級成年健康雄性SD大鼠，按隨機數字表法分為假手術組(Sham組,n=30)；膿毒癥組(Sepsis組，n=30)；低分子肝素治療組(LMWH組,n=30)，每個小組根據不同時間點分為6 h，12 h，24 h 3個亞組每個亞組10只。Sham組經麻醉后開腹，僅翻動盲腸；Sepsis組行盲腸結扎術并穿孔，并注射等量生理鹽水；LMWH組經CLP術后立即皮下注射低分子肝素鈉注射液(100 U/kg)，分別在每個時間點各組分別采血，并處死大鼠取肺組織。光鏡下觀察肺組織HE染色圖片，肺組織切片經Hoechst33258染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察VEC的凋亡。

1.4CLP動物模型制備 各組大鼠術前禁食不禁水12 h，經腹腔注射1%戊巴比妥鈉注射液(0.1 g/kg)麻醉大鼠后仰臥位固定在操作臺上，頸部和腹部備皮。大鼠膿毒癥模型的制備采用改良CLP法〔6〕。CLP具體方法：選中下腹正中切口1.5 cm左右，用4號無菌縫合線結扎盲腸根部，整個操作過程動作輕柔注意避開血管，在距盲腸末端1 cm處開一直徑約0.5 cm的小孔后擠出黃豆粒大小糞便，然后把盲腸納回腹腔，離斷雙側網膜，逐層縫合關閉腹腔。各組術后立即皮下注射50 ml/kg乳酸鈉林格液，補充手術過程中的體液丟失。所有大鼠實驗期間禁食經靜脈給予營養支持，每日攝入總熱量均控制在70 kCal/只左右，此為正常成年大鼠每日正常生理需要量。

1.5指標的檢測方法 對膿毒癥大鼠內皮細胞損傷標志物的測定方法：肺組織HE染色后在光鏡下觀察，肺組織病理損傷改變程度判定采用 Smith 評分法〔7〕對肺水腫、肺泡和肺間質炎性細胞浸潤、肺泡和肺間質出血、肺不張情況進行評價，分別進行0～4分半定量分析〔8〕：無損傷為0分， 病變范圍<25%為1分， 26%～50%為2分， 51%～75%為3分， >75%或滿視野為4分， 總肺損傷程度為上述各項總和。每只動物觀察10個高倍視野(200倍)，然后取其平均值。Hoechst33258染色法在免疫熒光顯微鏡下觀察肺VEC的凋亡，每組隨機取10個肺小血管的視野，應用Imagepro-plus6.0生物專業圖像分析軟件計算進行光密度分析，對其中VEC陽性顆粒的平均光密度進行測定。

1.6統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗及秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組肺組織病理學觀察 Sham組肺泡結構完整，肺泡壁未見水腫增厚，未見炎性細胞浸潤；Sepsis組隨時間延長肺泡壁增厚增加并伴有炎性浸潤增多，肺毛細血管擴張明顯并伴有肺間質組織水腫。至24 h肺組織中肺泡間隔增寬并發生斷裂，肺泡腔內有大量紅細胞和白細胞浸潤。LMWH組肺泡水腫及炎性細胞浸潤的現象與Sepsis組相比顯著減慢(見圖1)。LMWH組肺臟病理損傷評分顯著低于Sepsis組(P<0.05)，在6 h最為顯著，見表1。

圖1 各組肺組織病理學(HE，×200)

組別6 h12 h24 hSham組0.32±0.0160.45±0.0220.39±0.027Sepsis組2.77±0.0241)3.62±0.0421)4.01±0.0381)LMWH組1.79±0.0291)2)2.15±0.0371)2)2.87±0.0411)2)

與Sham組比較：1)P<0.01；與Sepsis組比較：2)P<0.05

2.2Hoechst33258染色法觀察肺VEC的凋亡 Sham組細胞核內DNA分布均勻，未見核固縮，鏡下呈體積較大的淺染核形態。Sepsis組、LMWH組均見不同程度核固縮，其中S組細胞核內DNA濃聚，核呈現核固縮，在視野中為致密濃染或為碎塊狀致密濃染的細胞核形態，具有典型的細胞凋亡特征，且隨著時間延長，VEC凋亡顯著增加； LMWH組較Sepsis組VEC凋亡進展緩慢(見圖2)。LMWH組平均光密度顯著低于Sepsis組，差異具有統計學意義(P<0.01，見表2)。

圖2 各組各時間點肺臟Hoechst33258染色(×200)

組別6 h12 h24 hSham組0.68±0.0240.63±0.0350.71±0.019Sepsis組1.73±0.0301)2.08±0.0271)2.96±0.0341)LMWH組0.88±0.0251)2)1.57±0.0321)2)1.84±0.0281)2)

與Sham組比較：1)P<0.01；與Sepsis組比較：2)P<0.01

3 討 論

膿毒癥在臨床上主要表現為全身炎癥反應和組織器官功能障礙。其中器官功能障礙集中表現為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和休克等。VEC作為效應細胞在膿毒性和多器官功能損傷中發揮著至關重要的作用〔9〕。由于肺組織毛細血管密集且面積巨大，膿毒癥導致大量的紅細胞和白細胞滯留于肺毛細血管網中并釋放大量的炎性介質，直接或間接的造成VEC的損傷和凋亡。

本研究結果顯示，膿毒癥時大鼠的肺損傷隨病情的進展逐漸加重，表明在膿毒癥時VEC嚴重損傷，導致肺微血管通透性顯著增加，造成肺組織水腫，與Wu等〔10〕研究一致，而低分子肝素對膿毒癥肺損傷具有保護作用。由于內皮細胞活化可以導致微血管病變，微血管通透性增加，白細胞黏附和遷移，活性氧家族的活化，血管擴張和細胞因子的產生并致組織缺氧，炎癥反應失衡最終導致器官功能障礙甚至死亡〔11〕，低分子肝素對膿毒癥肺損傷的保護作用可能是通過其抗炎作用減輕了微血管的通透性而實現的。

由于膿毒癥時，大量的白細胞在肺毛細血管中聚集，從而使多形核中性粒細胞(PMN)被激活并釋放大量的炎性介質，直接導致肺VEC受到廣泛性損傷和發生凋亡〔12〕。Hoechst33258為非嵌入性藍色熒光染料，能在活細胞中DNA聚AT序列富集區域的小溝處與DNA結合?；罴毎蚬潭ǖ募毎軌驈牡蜐舛热芤褐袛z取Hoechst33258，從而使細胞核著色且呈彌散均勻熒光，故而又把此染料稱為DNA探針。在細胞發生凋亡時，細胞核或細胞質均可見致密濃染的顆粒塊狀熒光，因此無須使用二氨基聯苯胺(DAB)顯色亦可直接檢測細胞凋亡。本研究結果顯示在發生膿毒癥時，VEC易發生凋亡，而低分子肝素能減輕膿毒癥肺VEC的凋亡，其機制可能是由于低分子肝素通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子(NF)-κB的活性，從而減少了腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達，減輕炎癥反應降低了內皮細胞的通透性，減輕了肺損傷的程度〔13,14〕。 綜上所述，低分子肝素能減輕膿毒癥肺損傷程度并對膿毒癥肺VEC的損傷起到保護作用。但低分子肝素干預作用治療膿毒癥的機制仍不是十分清晰，有待今后深入研究。