慢性溫和應(yīng)激對(duì)快速老化小鼠模型骨代謝水平和骨強(qiáng)度的影響

張耀武 洪漢剛 陳平波

(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院骨科，新疆 烏魯木齊 830000)

老年性骨質(zhì)疏松是目前臨床上最常見的一種原發(fā)性骨質(zhì)疏松類型，發(fā)生骨折的危險(xiǎn)性顯著增加〔1〕。骨質(zhì)疏松的重要危險(xiǎn)因素之一是抑郁，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，抑郁易使患者骨量顯著下降〔2，3〕。但對(duì)骨質(zhì)疏松與應(yīng)激狀態(tài)之間的確切聯(lián)系需要進(jìn)一步研究。本研究旨在觀察和分析慢性溫和應(yīng)激狀態(tài)對(duì)快速老化小鼠(SAM)-P6模型骨代謝水平和骨強(qiáng)度的影響，為防治老年骨質(zhì)疏松提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇3月齡的雄性SPF級(jí)SAM-P6小鼠36只(購自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合格證號(hào)：SYXK(新)2015-0002)，體重(21.68±1.03)g。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需要在相同環(huán)境條件下進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，均給予正常飲食，設(shè)定環(huán)境溫度為(23.00±1.20)℃，平均相對(duì)濕度55%，每日進(jìn)行光照和黑暗條件12 h，并循環(huán)交替進(jìn)行，在進(jìn)行1 w的飼養(yǎng)后使得實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與取材 采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組18只。實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行不可預(yù)見性慢性溫和應(yīng)激(UCMS)，同時(shí)參考相關(guān)研究〔4〕制備改進(jìn)型的UCMS小鼠模型，實(shí)驗(yàn)小鼠每日接受刺激的時(shí)間隨機(jī)選取，刺激項(xiàng)目則隨機(jī)選擇以下〔5〕：①電擊足底(電流強(qiáng)度10 mA，間隔1 min刺激1次，共計(jì)30次)；晝夜顛倒(24 h)；②冰水游泳，每日8次，每次持續(xù)15 min；③熱刺激，每日進(jìn)行電暖器照明取暖，持續(xù)15 min；④去除墊料，持續(xù)24 h；⑤飼養(yǎng)環(huán)境溫度改變，24 h內(nèi)進(jìn)行更替；⑥傾斜鼠籠，持續(xù)24 h；⑦將小鼠放置在塑料管內(nèi)，對(duì)其活動(dòng)進(jìn)行限制活動(dòng)，持續(xù)60 min，然后夾尾2 min。需要注意的是，上述刺激形式不連續(xù)出現(xiàn)，刺激狀況維持4 w。對(duì)照組小鼠則不進(jìn)行任何形式的刺激，在正常環(huán)境中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組小鼠在進(jìn)行4 w的持續(xù)刺激后，需禁食12 h，然后將各組小鼠摘除眼球，取血，頸椎脫臼法處死小鼠，將其股骨迅速剝離，需要注意的是需將股骨周圍附著的肌肉組織盡量剔除，但不要損傷骨皮質(zhì)，保持股骨段完整，然后將股骨段用被生理鹽水浸透的紗布進(jìn)行包裹，置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3血清學(xué)指標(biāo)的測定 血清中鈣、磷和堿性磷酸酶(ALP)含量測定選擇全自動(dòng)化生化分析儀，血清內(nèi)骨鈣蛋白及Ⅰ型膠原氨基末端肽(NTx)水平則采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行測定。

1.4微型CT(micro-CT)檢測 在室溫條件下將備用股骨樣本解凍，置于micro-CT系統(tǒng)檢測管內(nèi)，在高分辨率下沿標(biāo)本長軸方向進(jìn)行樣本掃描，掃描厚度設(shè)定為20 μm，從而獲取樣本的連續(xù)micro-CT圖像。樣本進(jìn)行掃描后完成整體結(jié)構(gòu)重建，感興趣區(qū)域(ROI)選在股骨近端骨組織，用三維直接測量法對(duì)骨微結(jié)構(gòu)中的數(shù)據(jù)參數(shù)進(jìn)行分析，主要數(shù)據(jù)參數(shù)有骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁相對(duì)體積(BV/TV)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組小鼠的一般狀況 實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)據(jù)均納入分析，無任何脫落。實(shí)驗(yàn)初，兩組小鼠平均體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在進(jìn)行持續(xù)4 w的應(yīng)激刺激后，實(shí)驗(yàn)組體重明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。與實(shí)驗(yàn)初對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢隗w重顯著降低(P<0.05)，對(duì)照組未出現(xiàn)顯著變化(P>0.05)。見表1。

表1 兩組小鼠體重比較

2.2兩組血清學(xué)指標(biāo)對(duì)比 與對(duì)照組對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組血清鈣及ALP水平顯著提高(P<0.05)，兩組血磷水平對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組血清骨鈣蛋白含量顯著下降，血清NTx含量明顯提高(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清學(xué)指標(biāo)對(duì)比

2.3兩組micro-CT檢測指標(biāo)比較 實(shí)驗(yàn)組BMD顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組BV/TV、Tb.N明顯下降(P<0.05)；Tb.Th降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Tb.Sp增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組micro-CT指標(biāo)對(duì)比

3 討 論

在老年骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中，最為經(jīng)典的是快速老化小鼠SAM-P6模型，該模型能夠使得動(dòng)物在6～8 w內(nèi)出現(xiàn)顯著老化〔6〕。本研究為了能夠排除機(jī)體雌激素水平對(duì)結(jié)果的影響，選擇雄性SAM-P6模型納入研究，從而可以有效觀察慢性溫和應(yīng)激對(duì)老年骨質(zhì)疏松相關(guān)指標(biāo)的影響。相關(guān)研究結(jié)果表明〔7〕，慢性溫和應(yīng)激會(huì)使骨質(zhì)疏松相關(guān)指標(biāo)出現(xiàn)變化，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松加重，表明慢性溫和應(yīng)激狀態(tài)可能在骨質(zhì)疏松發(fā)病、進(jìn)展及治療過程中可能發(fā)揮重要作用。在骨骼礦化過程中，鈣是一種基本物質(zhì)，骨基質(zhì)的合成及骨礦沉積過程中磷發(fā)揮重要作用，對(duì)骨細(xì)胞攝入鈣造成影響，最終改變骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能〔8〕。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠接受慢性溫和應(yīng)激處理，小鼠血鈣、血磷均明顯升高，分析原因可能與應(yīng)激狀況能夠顯著改變神經(jīng)內(nèi)分泌，導(dǎo)致骨代謝紊亂等因素存在相關(guān)性〔9〕。在骨礦化過程中，ALP作為一種非膠原蛋白在其中扮演重要角色，在成骨活躍時(shí)是由成骨細(xì)胞分泌〔10〕。在血清中50%的ALP是由成骨分泌產(chǎn)生，因此，在一定程度上，血清ALP水平反映骨代謝的變化情況。相關(guān)研究結(jié)果顯示〔11〕，在機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)骨質(zhì)快速流失或是存在骨折風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，機(jī)體內(nèi)血清ALP水平明顯升高，分析其原因可能是骨吸收的加劇，導(dǎo)致代償性骨形成以及骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng)。本次研究中，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清ALP水平明顯增加，表明慢性溫和應(yīng)激狀態(tài)下骨轉(zhuǎn)換顯著增強(qiáng)。

對(duì)機(jī)體尿液或血清內(nèi)較為敏感的骨轉(zhuǎn)化生化標(biāo)志物進(jìn)行檢測，能夠明確機(jī)體骨代謝狀態(tài)〔12〕。在骨代謝過程中，骨鈣蛋白是由成骨細(xì)胞合成、分泌，能夠有效反映成骨代謝狀況的血清學(xué)特異性敏感指標(biāo)，骨代謝紊亂時(shí)并不影響其特異性〔13〕。在礦化骨中，NTx是由I型膠原降解產(chǎn)生的交聯(lián)物中的重要部分。機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)骨吸收時(shí)，NTx釋放入血，少部分在尿液中出現(xiàn)，能夠特異性反映骨吸收狀況，是一種較為敏感的指標(biāo)〔14，15〕。本研究在對(duì)小鼠血清內(nèi)的骨鈣蛋白及NTx進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，在慢性溫和應(yīng)激狀態(tài)下的小鼠血清骨鈣蛋白水平明顯下降，NTx顯著上升，表明實(shí)驗(yàn)組小鼠成骨成分減少，破骨增加，骨轉(zhuǎn)化率增加，提示慢性溫和應(yīng)激狀態(tài)對(duì)骨代謝和穩(wěn)定是不利的。骨質(zhì)疏松最為重要的特征之一是BMD下降及骨結(jié)構(gòu)異常，對(duì)實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物的骨量丟失及骨結(jié)構(gòu)改變情況進(jìn)行觀察的主要方式是micro-CT法，該技術(shù)手段可以對(duì)BMD改變情況進(jìn)行密切觀察，還能夠評(píng)價(jià)骨質(zhì)量變化情況，比傳統(tǒng)雙能X線吸收測量法(DEXA)更具優(yōu)勢(shì)〔16，17〕。本研究結(jié)果表明，慢性溫和應(yīng)激狀態(tài)能夠顯著改變骨強(qiáng)度，使得骨質(zhì)疏松患者的骨微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化。

本次研究仍存在一些不足之處。實(shí)驗(yàn)時(shí)間僅為4 w，觀察時(shí)間不足；缺少骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測及骨生物力學(xué)測量等指標(biāo)數(shù)據(jù)對(duì)骨質(zhì)變化情況進(jìn)一步觀察；SAM-P6動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢H能反映人體老化的部分特征，若要獲得骨質(zhì)疏松的更多臨床特征，需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)。