癲癇模型大鼠認(rèn)知功能與海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖的變化及OrexinA的影響機(jī)制

王軍 劉增良 劉洋 伊超 秦向英 于海明 才艷雪

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

65歲以上老年人癲癇發(fā)病率最高，發(fā)病率與年齡呈現(xiàn)正相關(guān)，在過去的20年里，老年患者以每年3.5%的增長率增多〔1～5〕。癲癇患者的認(rèn)知功能減退主要與破壞神經(jīng)元及進(jìn)一步打破神經(jīng)肽與遞質(zhì)的平衡有關(guān)，而OrexinA(OXA)作為興奮性神經(jīng)肽，對機(jī)體能量代謝、進(jìn)食及認(rèn)知功能等方面可發(fā)揮較大作用〔6,7〕。研究指出，OXA對于細(xì)胞生長與增殖影響效果顯著，其機(jī)制可能與激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)有關(guān)〔5〕。本研究以癲癇大鼠模型為研究對象，探討OXA對癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響效果及細(xì)胞增殖情況。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 常規(guī)飼養(yǎng)1 w后，選擇曠場實(shí)驗(yàn)評分接近的SD清潔級大鼠50只，體重(180±20)g，實(shí)驗(yàn)大鼠均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與側(cè)腦室注射方法 按照隨機(jī)數(shù)字法對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行分組，共計(jì)5組，每組各10只，即：對照組及實(shí)驗(yàn)組，其中實(shí)驗(yàn)組又分為戊四唑(PTZ)+生理鹽水組(1組)、PTZ+OXA組(2組)、ERKl /2抑制劑組，即：PTZ+U0126(3組)及PTZ+U0126+OXA組(4組)。

將造模成功的大鼠，在腦立體定位儀上通過不銹鋼微導(dǎo)管插入后固定進(jìn)行注射。對照組與1組均注射8 μl生理鹽水，2組注射等量的1.5 nmol/μl的OXA，3組注射等量U0126，4組分別注射等量OXA、U0126，各組注射均為每日1次，而后均進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，7 d后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3主要試劑及儀器

1.3.1試劑 PTZ、溴脫氧尿核苷尿嘧啶(BrdU)抗體(圣克魯斯生物技術(shù)公司)；小鼠抗大鼠BrdU單克隆抗體、山羊抗大鼠雙腎上腺皮質(zhì)激素(DCX)多克隆抗體(上海研晶生化試劑有限公司)；OXA(上海玉博生物科技有限公司)；U0126(上海拜力生物科技有限公司)；兔抗山羊IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3.2儀器 泰盟Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，型號：WMT-100，成都泰盟軟件有限公司；腦立體定位儀，型號：NDY-2，天津市醫(yī)療器械研究所；微量注射器，北京銘泰佳信科技有限公司。

1.4動物造模方法 1～4組動物均予以腹腔注射PTZ，30 mg/kg，注射后觀察1 h左右，連續(xù)注射1個月。癲癇模型成功標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)Ravine分級標(biāo)準(zhǔn)，以連續(xù)出現(xiàn)3次Ⅳ級以上的癥狀，主要為雙側(cè)前肢抽搐，同時伴身體直立。

1.5指標(biāo)檢測及方法

1.5.1認(rèn)知功能檢測 采用Morris水迷宮試驗(yàn)進(jìn)行檢測，主要檢測內(nèi)容涵蓋定位航行試驗(yàn)、空間搜索試驗(yàn)，其中前者為造模后連續(xù)注射7 d藥物后，將大鼠放入泳池中進(jìn)行試驗(yàn)，第1天熟悉環(huán)境，第2天開始從四個象限各入水1次進(jìn)行試驗(yàn)，2次/d，記錄大鼠2 min內(nèi)尋找平臺的路線和游泳速度，并記錄逃避潛伏期，即大鼠爬上平臺所用時間，若大鼠限制時間內(nèi)未找到平臺，將其導(dǎo)引至平臺休息30 min；后者試驗(yàn)內(nèi)容在完成第1個試驗(yàn)第2天，拿掉泳池中平臺，固定某一個象限為入水象限，記錄大鼠2 min內(nèi)的空間搜索指標(biāo)，即：經(jīng)過平臺所在位置的次數(shù)和在平臺所在象限的游泳時間。

1.5.2海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖變化 采用免疫熒光染色法對海馬齒狀回BrdU和DCX表達(dá)進(jìn)行檢測，在各組大鼠進(jìn)行認(rèn)知功能檢測的12 h、24 h后進(jìn)行BrdU熒光標(biāo)記，以100 mg/kg進(jìn)行腹腔注射，7 d后麻醉大鼠，先后進(jìn)行生理鹽水、4%多聚甲醛溶液灌注，取腦組織進(jìn)行海馬切片，修復(fù)抗原30 min后，根據(jù)免疫熒光染色步驟依次操作，最后觀察BrdU和DCX的熒光表達(dá)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠情況分析 造模后，共計(jì)死亡老鼠3只，經(jīng)過解剖分析，未見異常。造模未成功大鼠4只，進(jìn)入試驗(yàn)的各組大鼠例數(shù)為，對照組10只，1組8只、2組9只、3組8只、4組8只。

2.2海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖變化 BrdU、DCX表達(dá)均多集中在齒狀回顆粒下區(qū)，且兩種細(xì)胞表達(dá)區(qū)域多有交叉，即：BrdU+/DCX+表達(dá)亦多集中于齒狀回顆粒下區(qū)。與對照組比較，1～4組BrdU+細(xì)胞表達(dá)、BrdU+/DCX+表達(dá)均有所增加，DCX+細(xì)胞表達(dá)則有所減少；與1組比較，2、4組的BrdU+細(xì)胞表達(dá)、BrdU+/DCX+表達(dá)均有所減少，DCX+細(xì)胞表達(dá)則有所增加，3組的相關(guān)指標(biāo)則呈相反表現(xiàn)；與2組比較，4組BrdU+細(xì)胞表達(dá)、BrdU+/DCX+表達(dá)均有所增加，DCX+細(xì)胞表達(dá)則有所減少。見圖1～3。

圖1 海馬齒狀回BrdU+細(xì)胞表達(dá)(×400)

圖2 海馬齒狀回DCX+細(xì)胞表達(dá)(×400)

圖3 海馬齒狀回BrdU+/DCX+細(xì)胞表達(dá)(×400)

2.3認(rèn)知功能檢測

2.3.1定位航行試驗(yàn)結(jié)果 隨著時間的延長，對照組與其余4組的逃避潛伏期均顯著縮短(P<0.05)。與對照組比較，1～4組的逃避潛伏期均明顯延長(P<0.01)；1、3、4組比較，2組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較

與對照組比較：1)P<0.01；與2組比較：2)P<0.05;同組間與前一時間點(diǎn)比較:3)P<0.05

2.3.2空間搜索試驗(yàn)結(jié)果 與對照組比較，1～4組的穿越平臺次數(shù)、平臺象限游泳時間均明顯減少(P<0.01);與1組比較，2、4組的穿越平臺次數(shù)、平臺象限游泳時間均明顯增加(P<0.01)，3組的相關(guān)指標(biāo)則明顯減少(P<0.01);與2組比較，4組穿越平臺次數(shù)、平臺象限游泳時間明顯縮短(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠空間搜索試驗(yàn)結(jié)果比較

與對照組比較：1)P<0.01；與1組比較：2)P<0.01；與2組比較：3)P<0.01

3 討 論

隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，對于癲癇的研究不再停留在對于病情的控制，而更多的關(guān)注于對于生活質(zhì)量的提高之中，而生活質(zhì)量對于癲癇患者來講，大多集中在改善認(rèn)知功能，即：學(xué)習(xí)與記憶能力，減少本病對于患者工作與生活的影響〔1〕。

研究認(rèn)為，癲癇的發(fā)病與海馬神經(jīng)、突觸等相關(guān)結(jié)構(gòu)與功能的損傷有關(guān)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)失衡等原因，誘發(fā)患者出現(xiàn)認(rèn)知功能異常〔8〕，而反復(fù)發(fā)作致使患者的OXA水平降低，亦是引發(fā)認(rèn)知功能障礙的原因〔9〕，尤其是對于重度患者而言，其海馬遷移、增殖能力損傷明顯，從而導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)異常的神經(jīng)元環(huán)路，損傷學(xué)習(xí)記憶能力〔10,11〕。

本研究結(jié)果表明，癲癇大鼠出現(xiàn)逃避潛伏期縮短，空間記憶能力降低的癥狀，OXA能逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象，而進(jìn)一步進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞增殖的表現(xiàn)觀察則發(fā)現(xiàn)，PTZ + OXA組齒狀回顆粒下層多見增殖的BrdU+細(xì)胞，由此，推測其機(jī)制可能由于樹突向分子層伸展與CA3區(qū)域的神經(jīng)元相連，從而共同構(gòu)建起局部突觸聯(lián)系，促進(jìn)生成長時程增強(qiáng)效應(yīng)(LTP)，最終提高記憶再現(xiàn)能力有關(guān)。

有研究指出，在癲癇發(fā)作過程中，可誘發(fā)ERK1/2的過度激活，從而加重腦組織損傷，但在疾病發(fā)作中ERK1/2存在一過性激活，可作為一種保護(hù)性代償反應(yīng)〔12〕。ERK1/2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用，其機(jī)制可能與其發(fā)揮協(xié)調(diào)神經(jīng)元對外界刺激信號及時做出反應(yīng)有關(guān)〔13,14〕，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERK1/2抑制劑可加重癲癇海馬CA3區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的損傷，但ERK1/2的激活可緩解癲癇大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力減退，而OXA可明顯抑制促進(jìn)新生顆粒細(xì)胞遷移至顆粒層，進(jìn)而改善認(rèn)知功能〔15〕，由此，推測OXA可改善癲癇患者的學(xué)習(xí)記憶的過程，其機(jī)制可能與激活ERK1/2，進(jìn)而抑制海馬區(qū)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性形成、促進(jìn)齒狀回顆粒細(xì)胞的增殖有關(guān)，但由于ERK1/2具有兩面性，如何防止其過度激活及其后續(xù)的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。