血漿內(nèi)毒素檢測在革蘭陰性菌引起肺部感染診斷中的應(yīng)用

楊 辛，吳穎稚，范 君，錢重玲，林 潔，李 菁，張慶五，曹啟迪

(1.上海市楊浦區(qū)控江醫(yī)院檢驗科，上海 200093； 2.上海市楊浦區(qū)滬東老年護理醫(yī)院檢驗科，上海 200082)

肺部感染是呼吸系統(tǒng)最常見多發(fā)的疾病之一，其病因是由于肺部感染病原微生物(以細菌感染為主)而引起的炎癥。免疫功能低下，臨床表現(xiàn)不典型，早期診斷困難。致使患者出現(xiàn)咳嗽、咳痰，伴或不伴胸痛，發(fā)熱。由于肺部感染病原體種類不同，感染何種病原體不明，無法針對敏感菌準確用藥，致使大量使用廣譜抗生素，造成致病微生物的基因發(fā)生改變而產(chǎn)生耐藥，其中以革蘭陰性菌最為突出[1-2]。所以臨床往往急需病原體檢測，而常規(guī)細菌培養(yǎng)所需時間較長，為4～6 d，而且采集標本易污染，真陽性率不高，不利于疾病治療[3]。近年來對細菌感染快速檢測診斷的新試驗項目不斷增加，血漿內(nèi)毒素對革蘭陰性菌感染早期鑒別具有一定的診斷價值，革蘭陰性菌的細胞壁上含有脂多糖，而其他革蘭陽性菌、真菌、動物及人的細胞成分和血漿中均不含脂多糖成分，如果在感染患者血漿中檢測到脂多糖，是診斷革蘭陰性菌感染的有效依據(jù)[4]。本研究采用血漿內(nèi)毒素動態(tài)光度比濁法對肺部感染患者脂多糖水平進行檢測，旨在探討其在革蘭陰性菌診斷中的應(yīng)用價值。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2018年5月上海市楊浦區(qū)控江醫(yī)院確診為肺部感染患者277例，其中男235例、女42例,年齡62～82歲，平均(73.3±1.2)歲；病程11～15 d,平均(13±2.0) d。納入標準；符合2009年《臨床診療指南；呼吸病學分冊》肺部感染的診斷標準[5]；排除標準：排除肺部腫瘤、肺水腫、肺不張、肺栓塞等疾病，病毒性感染，自身免疫性疾病及過敏性疾病所致免疫功能紊亂的患者。

1.2儀器和試劑 采用法國(梅里埃)VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀及相應(yīng)革蘭陽性菌，革蘭陰性菌藥敏卡均由法國梅里埃生物有限公司提供，上海市臨床檢驗中心提供細菌質(zhì)控標準菌株大腸埃希菌(ATCC25922),金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，銅綠假單胞菌(ATCC27853)由細菌室保存。血平板，麥康凱及巧克力平板均由上海市康勤科技有限公司提供，采用英國(萊伯金耐特)LKMO2-32型動態(tài)試管檢測儀(英國萊伯金耐特生物有限公司)檢測內(nèi)毒素水平，TAL-80試管恒溫儀、革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒(批號：1703240)及質(zhì)控品均由廣東湛江安度斯生物有限公司提供。

1.3方法

1.3.1血漿內(nèi)毒素檢測 采用革蘭陰性菌脂多糖動態(tài)光度濁法檢測血漿內(nèi)毒素水平:①采用無菌，無熱源真空采血管采集靜脈血3 mL，離心半徑為10 cm,3 000 r/m離心10 min后，吸取上層富有血小板的血漿0.1 mL加入0.9 mL樣品稀釋液中后，放入TAL-80試管恒溫儀中進行75 ℃保溫10 min和冷卻5 min后，配制成檢測血漿。②取0.25 mL試劑復溶液加入反應(yīng)試劑中，搖勻靜置2 min配制成反應(yīng)液。③加入0.1 mL檢測血漿和50 μL反應(yīng)液于反應(yīng)管中，混勻后插入LKM-02-32型動態(tài)試管測試儀中檢測75 min反應(yīng)結(jié)束后，自動計算血漿中內(nèi)毒素的含量[6-7]。血漿內(nèi)毒素定量檢測結(jié)果分析：<0.053 EU/mL為正常值；0.053～0.109 EU/mL為臨床觀察期；>0.109 EU/mL為革蘭陰性菌感染[8-9]。

1.3.2痰液細菌培養(yǎng)檢測 受試者晨起洗漱后，深咳留取痰液于無菌試管內(nèi)30 min送檢，收到標本后初步鏡檢和革蘭染色。合格標本判斷標準為鱗狀上皮細胞<10個/低倍視野，白細胞>25個/低倍視野為合格標本進行痰液培養(yǎng)[10]。先將痰液標本及時接種血平板，麥康凱和巧克力平板，放入35 ℃孵箱孵育24～48 h后取出。如懷疑有致病菌進行革蘭染色，鏡檢區(qū)分陽性和陰性，確定后挑取單個菌落于2.0 mL無菌0.9% NaCl溶液中，調(diào)整菌落濁度為0.5麥氏比濁度后，分別接種于鑒定藥敏板，放入VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀中，24 h后自動出結(jié)果[11]。痰液細菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果判定；根據(jù)文獻[12-13]，按法國梅里埃生物有限公司提供的VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀細菌鑒定評估標準說明書進行評定。

2 結(jié) 果

2.1痰細菌培養(yǎng)陽性率分布情況 277例肺部感染患者中，革蘭陰性菌感染196例，陽性率為79.76%，分別為大腸埃希菌30例，銅綠假單胞菌52例，肺炎克雷伯菌94例，奇異性變形桿菌12例，鮑曼不動桿菌8例。革蘭陽性菌感染81例，陽性率為29.24%，分別為金黃色葡萄球菌72例，肺炎雙球菌9例。

2.2內(nèi)毒素含量水平檢測結(jié)果比較 196例革蘭陰性菌感染患者血漿內(nèi)毒素水平為(0.283±0.108) EU/mL，81例革蘭陽性菌感染患者血漿內(nèi)毒素水平為(0.034±0.010) EU/mL。革蘭陰性菌感染組與革蘭陽性菌感染組內(nèi)毒素水平比較差異有統(tǒng)計學意義(t=29.773,P=0.001)。

2.3血漿內(nèi)毒素與痰液細菌培養(yǎng)檢測結(jié)果比較 以細菌培養(yǎng)結(jié)果作為金標準，血漿內(nèi)毒素檢測的靈敏度為97.44%，特異度為83.95%，陽性預測值為94.08%，陰性預測值為93.24%,準確度為93.86%。見表1。

表1 血漿內(nèi)毒素與痰細菌培養(yǎng)檢測陽性結(jié)果比較 (例)

3 討 論

內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細胞壁中的一種成分，稱之為脂多糖。脂多糖對宿主具有毒性作用。內(nèi)毒素只有當細菌死亡或裂解破壞菌細胞后才釋放出來。革蘭陰性菌是肺部感染的主要致病菌，臨床上最常用痰培養(yǎng)來鑒定感染細菌的種類，并同時提供藥物敏感試驗結(jié)果。但培養(yǎng)時間較長，需4～6 d，無法提供及時的檢驗結(jié)果[14]。近年來，實驗室運用血漿內(nèi)毒素檢測，不但可以快速鑒別致病菌種類，而且具有高度敏感性，尤其是革蘭陰性菌感染，檢測時間短，操作簡單僅需2 h便可出結(jié)果，能及時為臨床醫(yī)師提供早期診斷和針對敏感菌如何應(yīng)用抗感染藥物治療進行有效指導[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，277例肺部感染患者中，痰細菌培養(yǎng)陽性率分別為革蘭陰性菌感染196例，陽性率為79.76%，革蘭陽性感染81例，陽性率為29.24%，革蘭陰性菌感染組血漿內(nèi)毒素水平明顯高于革蘭陽性感染組(P<0.01)，因為革蘭陰性菌裂解后釋放出來內(nèi)毒素是其細胞壁中的脂多糖組分，因此對于革蘭陰性菌致病的肺部感染的患者，檢測血漿內(nèi)毒素可以確定革蘭陰性菌感染，并且進行針對革蘭陰性菌的抗生素治療。如果肺部感染患者依賴血常規(guī)檢查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)白細胞計數(shù)升高不明顯或在正常參考值范圍以內(nèi)影響使用廣譜抗生素，等痰培養(yǎng)結(jié)果出來再調(diào)整用藥方案，肺部感染患者可能會因抗生素使用不當而發(fā)生不良反應(yīng)，產(chǎn)生延誤患者病情[17]。本研究以血漿內(nèi)毒素水平檢測值>0.109 EU/mL作為臨界值，血漿內(nèi)毒素與痰細菌培養(yǎng)檢測結(jié)果比較，血漿內(nèi)毒素的靈敏度和特異度分別為97.44%和83.95%，陽性預測值為94.08%，陰性預測值為93.24%,準確度為93.86%，效能較好。痰培養(yǎng)不能區(qū)分感染菌和定植菌，而血漿內(nèi)毒素能區(qū)分感染菌和定植菌，在對患者進行初步篩選過程中表現(xiàn)方便、快捷，所以血漿內(nèi)毒素為診斷革蘭陰性菌的有效方法。但是當人體局部或淺部革蘭陰性菌感染時，因脂多糖較少釋放入血或不入血，人體自身免疫系統(tǒng)能給予清除，造成血漿內(nèi)毒素檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。另外血漿內(nèi)毒素檢測也會出現(xiàn)極低比例的假陽性結(jié)果，而導致假陽性因素有試驗器材污染，患者用藥，血清標本高溶血,高脂及高膽紅素等。因此血漿內(nèi)毒素檢測結(jié)果應(yīng)與臨床患者體征相聯(lián)系：①新出現(xiàn)的咳嗽、咳痰或原有的呼吸道癥狀加重；②發(fā)熱；③肺實變體征和(或)聞及濕啰音；④白細胞計數(shù)>10×109/L或<4×109/L,伴或不伴中性粒細胞核左移；⑤胸部X線見片狀、斑片狀浸潤性陰影或間質(zhì)性改變。以上1～4項任何一項加上第5項的情況結(jié)合進行診斷和治療[17-18]。血漿內(nèi)毒素隨病情惡化而升高，隨病情緩解而降低，因此血漿內(nèi)毒素檢測可以作為監(jiān)測病情變化的參考指標，并且還可用于指導臨床用藥和治療。內(nèi)毒素鱟試驗檢測是通過酶的級聯(lián)反應(yīng)，內(nèi)毒素在二價陽離子參與激活C因子，然后激活其他酶原，產(chǎn)生一系列凝集美反應(yīng)，目前應(yīng)用鱟試驗陽性對肺部感染的進行診斷，血漿內(nèi)毒素水平>0.109 EU/mL為定量標準，并證實它對革蘭陰性菌肺部感染患者的判斷優(yōu)于痰培養(yǎng)[19-21]。

綜上所述，內(nèi)毒素檢測具備2 h得到檢測結(jié)果，因此對于臨床肺部感染患者應(yīng)動態(tài)監(jiān)測血漿內(nèi)毒素含量。在未得出細菌培養(yǎng)結(jié)果的情況下，可早期確定患者感染的細菌種類，以利于臨床合理選擇針對內(nèi)毒素的抗菌藥物，而及時的治療可以避免患者發(fā)生感染加重，導致不良后果。本法快速、簡單、準確性高，可用于革蘭陰性菌的輔助診斷。