Skp1蛋白在非小細胞肺癌組織和外周血中的表達水平及其臨床意義

朱嘉微，胡 簫，王希君，王雅茹，馮 林，肖 汀*

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室，癌發生及預防分子機理北京市重點實驗室，北京 100021)

目前肺癌仍是世界上癌癥死亡的主要原因，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的85%。雖然目前針對肺癌的早期篩查手段越來越多，但多數NSCLC患者(約占75%)在確診時已經處于中晚期，其癌組織已經發生轉移，即使通過手術切除，患者預后仍不樂觀[1]。研究顯示，大部分中晚期NSCLC患者的中位生存期為8～12個月[2]。因此，我們需要綜合評估中晚期NSCLC患者的預后，找到中晚期NSCLC發生發展的相關基因，從而篩選出潛在的預后評估指標。

在過去的十年間，泛素蛋白酶體系統已經成為開發新型抗癌療法的有效藥物靶點[3-5]。泛素蛋白酶體途徑是蛋白質水解的主要途徑。泛素級聯反應由一系列酶如E1、E2和E3催化而成，其中E3泛素連接酶負責靶蛋白的選擇[6-7]。泛素連接酶復合物(Skp1-Cullin-F-box，SCF)是由穩定亞基Skp1、Cul1、環指蛋白ROC/Rbx1和可變F-box共4部分組成[8]。S期激酶相關蛋白1(S-phase kinase-associated protein 1，Skp1)是SCF泛素連接酶復合體的特異性底物識別亞單位F-box家族的成員之一，在胚胎、宮頸、淋巴細胞、成骨細胞等不同類型的細胞和組織中普遍表達[9]。Skp1可以穩定F-box蛋白、增強底物結合能力[10]、參與細胞周期調控[11]，與腫瘤的發生發展密切相關[12]。已有研究證明SCF復合物在腫瘤的發生中起著關鍵作用，并且一些F-box蛋白已被證明是治療人類癌癥的潛在靶點[13]。然而，關于Skp1在NSCLC中的研究還比較少，其是否可以作為肺癌治療靶點仍待進一步研究。因此，本研究通過檢測Skp1在NSCLC組織和外周血中的蛋白水平，分析其與NSCLC臨床病理指標及患者預后的關系，為Skp1在臨床上的應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

本研究所用組織芯片共包含非小細胞肺癌及其癌旁組織樣本各86例，其中用于Western blot檢測的NSCLC及其配對的癌旁樣本各34例。本研究用于ELISA實驗的NSCLC血漿樣本39例。上述樣本均來自于中國醫學科學院腫瘤醫院胸外科2014年7月—2016年10月收治的患者，隨訪時間截止為2018年12月。本研究中ELISA試驗所用健康人血漿樣本共27例，來自中國醫學科學院腫瘤醫院體檢人群。所有樣本均取得研究對象的知情同意。

1.2 主要試劑

Skp1小鼠單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；β-actin小鼠單克隆抗體購于英國Abcam公司；山羊抗鼠IgG HRP二抗(Western blot)、蛋白提取試劑盒購于北京普利萊基因技術有限公司；蛋白定量試劑盒(BCATMprotein Assay Kit)購于Thermo Fisher公司；山羊抗鼠IgG HRP二抗(免疫組化用)、20×DAB顯色試劑盒購于MaxVision公司；封閉用正常山羊血清購于北京索萊寶科技有限公司；10×檸檬酸鹽抗原修復液(pH=6.0)、蘇木素染料均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；H2O2和氨水購于北京化工廠；Skp1 ELISA試劑盒購于Aviva Systems Biology公司。

1.3 Western blot實驗

取NSCLC組織及相應癌旁組織樣本各34例置于蛋白提取液(RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑∶PMSF=100∶1∶1)中，用勻漿器攪碎，使其充分裂解，離心，收集上清蛋白；蛋白濃度測定，繪制標準曲線；蛋白變性、定量后電泳(80 V，30 min；120 V，溴酚藍指示)；轉膜(250 mA，120 min)；封閉(3%脫脂牛奶，2 h)；孵育一抗(Skp1小鼠單克隆抗體，1∶200稀釋；β-actin小鼠單克隆抗體，1∶4 000稀釋)作用2 h；洗脫，孵育二抗(山羊抗鼠，1∶5 000)作用1 h；曝光成像。

1.4 免疫組化實驗及結果判定

將86例NSCLC組織及相應癌旁組織芯片置于烤箱中，65℃、烘烤5 h；組織芯片經脫臘、水化后置于3%H2O2溶液中，室溫、避光孵育10 min以去除細胞內源性過氧化物酶的活性；后經1×檸檬酸鹽進行抗原修復，正常山羊血清室溫封閉15 min，棄去封閉液，用一抗工作液(Skp1小鼠單克隆抗體，1∶100稀釋)4℃孵育過夜；之后，二抗室溫孵育20 min；DAB顯色，在顯微鏡下觀察染色強度；蘇木素染色；脫水；中性樹脂封片，顯微鏡下掃描觀察。

結果判定：免疫組化染色結果由兩位臨床病理醫師獨立判讀，根據細胞染色強度和陽性細胞所占比例進行綜合分析。其中細胞染色強度的評分標準為：0分(無黃棕色顆粒)，1分(淡黃色顆粒)，2分(棕黃色顆粒)，3分(褐色顆粒)；陽性細胞比例的評分標準為：0分(陽性細胞比例≤5%)，1分(5%＜陽性細胞比例≤25%)，2分(25%＜陽性細胞比例≤50%)，3分(50%＜陽性細胞比例≤75%)，4分(75%＜陽性細胞比例≤100%)。結果取兩者之積，分4個等級：0分記為(-)，1～4分記為(+)，5～8分記為(++)，9～12分記為(+++)[14]。最終將(-)和(+)定為蛋白低表達，將(++)和(+++)定為蛋白高表達。

1.5 ELISA方法

按照Skp1 ELISA試劑盒說明書來操作，包括梯度稀釋標準品；加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔，依次加入100μL不同濃度的標準蛋白、血漿樣品、標準蛋白稀釋液；37℃孵育1 h；棄去液體；每孔加入100μL Biotinylated Skp1 Detector Antibody工作液，37℃孵育1 h；棄去液體，每孔加入300μL洗滌液洗滌，重復3次；每孔加入100μL Avidin-HRP結合工作液，37℃孵育30 min；棄去孔內液體，洗滌液洗板5次；每孔加底物溶液90μL，37℃避光顯色30 min；每孔加入終止液50μL，終止反應，用酶標儀檢測各孔的D(450)值。

1.6 數據分析

使用Image J 1.8.0圖像軟件進行Western blot條帶灰度值處理；采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 7.0軟件進行數據統計分析。本研究中，患者的預后(disease-free survival，DFS)隨訪期為患者首次手術日期至發生復發、轉移或隨訪結束日期，用月計算。分別采用卡方檢驗和非配對T檢驗分析肺癌組織和外周血中Skp1的表達與各臨床指標之間的關系；采用Kaplan-Meier方法繪制肺癌患者的生存曲線，并進行Log-rank檢驗；采用多因素Cox回歸分析研究風險因素。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 Western blot檢測Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達

Western blot檢測34例NSCLC組織及相應癌旁組織樣本中Skp1蛋白的表達水平如圖1A所示，結果顯示Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，差異均具有統計學意義(P＜0.001)，見圖1B。

圖1 Western blot檢測Skp1蛋白在NSCLC組織和癌旁組織中的表達

2.2 免疫組化法檢測Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達

免疫組化法檢測86例NSCLC組織及癌旁組織樣本中Skp1蛋白的表達水平，結果顯示Skp1陽性表達主要定位于NSCLC細胞的細胞漿，呈棕黃色顆粒彌漫分布在細胞漿中(圖2)。Skp1蛋白在NSCLC組織中呈陽性高表達，陽性表達率為47.7%(41/86)，Skp1蛋白在癌旁組織中低表達，陽性表達率為10.5%(9/86)，差異具有統計學意義(P＜0.001)。Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達與腫瘤的臨床分期、病理類型、淋巴結轉移、分化程度等因素無顯著相關關系(P＞0.05)，見表1。

圖2 免疫組織化學染色檢測Skp1蛋白在NSCLC組織及癌旁組織中的表達

表1 NSCLC組織中Skp1蛋白的表達水平與臨床指標之間的關系

2.3 ELISA檢測Skp1蛋白在NSCLC患者血漿中的表達水平

ELISA檢測Skp1在39例NSCLC患者血漿及27例健康人血漿中的蛋白水平，結果顯示Skp1在NSCLC患者血漿中的蛋白濃度顯著高于健康人群(P=0.003)(圖3)。以所有受試人群外周血中Skp1蛋白濃度的中位數(90.65 pg/mL)為臨界點，將受試人群分為兩組，分別為：Skp1低水平組(＜90.65 pg/mL)和Skp1高水平組(≥90.65 pg/mL)。統計學分析顯示Skp1蛋白在非小細胞肺癌外周血中的表達水平與腫瘤的臨床分期、病理類型、淋巴結轉移、分化程度等因素無顯著相關關系(P＞0.05)。Skp1蛋白在NSCLC患者外周血中的表達水平與各臨床參數之間的關系見表2。

圖3 ELISA檢測Skp1蛋白在NSCLC患者血漿中的表達水平

表2 NSCLC患者外周血中Skp1蛋白的表達水平與臨床指標之間的關系

2.4 Skp1蛋白在NSCLC組織中的表達與患者預后的關系

本研究中共79例NSCLC患者有相應的預后信息(復發轉移及生存情況)，其中包含35例早期(I)患者，44例中晚期(II+III)患者；37例低分化患者，42例高中分化患者。隨訪時間3～54個月，中位隨訪時間34個月。用Kaplan-Meier預后分析表明，在早期(I)NSCLC患者中，Skp1蛋白高表達和低表達患者間預后差異不顯著(P=0.140，圖4A)，而在中晚期(II+III)患者中，Skp1蛋白高表達的NSCLC患者預后顯著差于Skp1低表達的患者(P=0.001，圖4B)。在分化程度比較低的NSCLC患者中，Skp1蛋白高表達的NSCLC患者的預后顯著差于Skp1低表達的患者(P=0.004，圖4C)。而在分化程度比較高的NSCLC患者中，則差異不顯著(P=0.699，圖4D)。多因素Cox回歸分析結果顯示，Skp1蛋白可以作為判斷中晚期(II+III)NSCLC患者預后的獨立危險因素(P=0.006，表3)。

圖4 Kaplan-Meier生存分析組織中Skp1蛋白表達水平與NSCLC患者預后的關系(n=79)

3 討論

非小細胞肺癌是一種高發病率、高致死率的惡性腫瘤。尤其處于中晚期的肺癌患者，即使通過手術切除，患者復發轉移、死亡的幾率依舊很高。因此，我們需要進一步找到中晚期NSCLC發生發展的相關基因，從而篩選出潛在的預后指標，為臨床評估提供一定的理論依據。

近幾年的研究發現，SCF泛素連接酶復合體(Skp1-Cullin-F-box)可以通過泛素依賴的蛋白水解途徑降解細胞周期相關蛋白，參與細胞增殖與凋亡的調控，進而影響腫瘤的發生發展[15]。Yu等[16]研究發現Skp1/Skp2/Cul1復合體可以選擇性的靶向p21和cyclin D蛋白，并進行泛素化降解，該復合體的異常表達可能會調控G1期細胞周期調控因子的蛋白表達水平，進而參與腫瘤的形成過程。Hussain等[5]在肺癌中的研究結果表明干擾Skp1基因的表達能明顯抑制肺癌細胞的生長、增殖、克隆活性和G2/M期阻滯，表明Skp1與肺癌發生發展和患者生存密切相關。此外，將Skp1從F-box中分離出來會引起F-box相關蛋白(ALK/NIPA、Skp2和TRCP)的降解，進一步表明Skp1表達水平的升高可能會促進SCF連接酶的致癌活性。Cul1在黑色素瘤、乳腺癌和肺癌中高表達，促進癌細胞的增殖，并且Cul1的高表達與腫瘤患者的不良預后有關[17-18]。含β-轉導素重復的E3泛素蛋白連接酶(betatransducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase，β-TRCP)通過介導泛素化途徑降解IkBα從而激活核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，增強β-catenin轉錄活性[19]。大量研究發現Skp2基因與肺癌的侵襲、浸潤、淋巴結轉移和患者預后顯著相關。Wang等[20]在黑色素瘤細胞中的研究顯示Skp2能通過介導MutT同源物1(MutT homolog 1，MTH1)的穩定性，抑制氧化應激引起的DNA損傷和細胞凋亡，進而促進黑色素瘤細胞的生存。Takanami等[21]用RT-PCR和免疫組織化學染色方法研究了79例NSCLC組織標本Skp2的表達水平與臨床參數及預后的關系，發現Skp2與病理分期、組織學亞型、血管侵襲、淋巴結轉移等因素顯著相關，并且Skp2高表達的NSCLC患者生存率顯著偏低。此外，多因素COX分析表明Skp2是肺癌患者預后的獨立危險因素，提示其可作為NSCLC侵襲性強和不良預后的潛在指標。Zhang[22]和Ding等[23-24]研究發現Skp2是骨肉瘤的一個潛在治療靶點，Skp2在骨肉瘤細胞中高表達，并且其高表達與骨肉瘤患者的不良預后有關，干擾Skp2基因表達能夠減少骨肉瘤細胞的增殖和侵襲，降低體內肺轉移。Wang等[13]研究發現致癌性E3連接酶通過降解腫瘤抑制因子使細胞無限增殖、基因組不穩定，從而發生細胞惡性轉化。

表3 多因素Cox回歸分析臨床指標和Skp1蛋白表達水平與中晚期(II+III)NSCLC患者預后的關系

越來越多的實驗和研究證明，在人類多種癌癥中，SCF復合物，包括核心組分(Cul1和Rbx1)和受體組分(Skp2和β-TRCP等)的差異過表達與腫瘤發生、發展和患者不良預后密切相關[25-27]。然而，關于Skp1在NSCLC中的研究還比較少，其是否和SCF其他組分一樣與肺癌患者預后相關，以及是否可以作為肺癌治療靶點仍有待研究。因此，本研究通過檢測Skp1在NSCLC組織和外周血中的蛋白表達水平，分析探索其與NSCLC臨床病理指標及患者預后的關系，為Skp1在臨床上的應用提供一定的理論依據。我們本次的研究發現Skp1也有類似的現象，本研究通過Western blot、免疫組化和ELISA分別檢測了Skp1在NSCLC和正常人組織及外周血中Skp1蛋白的表達水平，發現Skp1蛋白在NSCLC中顯著高表達(P＜0.01)。Kaplan-Meier單因素生存分析顯示，在中晚期(II+III)NSCLC患者以及低分化NSCLC患者中，Skp1蛋白高表達的NSCLC患者的預后均顯著差于Skp1低表達的患者(P＜0.01)，多因素Cox回歸分析顯示Skp1蛋白可以作為判斷中晚期(II+III)NSCLC患者預后的獨立危險因素(P＜0.01)。這提示著Skp1基因可能作為癌基因參與到NSCLC的進程，并且NSCLC惡性程度越高Skp1影響越顯著。雖然研究已經發現Skp1在NSCLC患者中異常表達，并且可能作為癌基因參與NSCLC發生發展的進程，但仍有很多生物學功能方面的問題需要解答：Skp1是通過什么信號傳導機制結合到F-box蛋白上，其異常表達又是如何影響SCF復合體的致癌性；Skp1在機體又是受什么信號誘導發生異常表達，進而參與癌癥進程等，有待進一步的細胞功能學實驗驗證和研究。相較于其他分子而言，目前對于Skp1的研究卻很少，值得我們進一步探索。

綜上所述，本研究發現Skp1蛋白在NSCLC患者組織和外周血中顯著高表達，并且其在NSCLC組織中的高表達與患者的不良預后顯著相關，是惡性腫瘤發生發展中的關鍵分子，這提示Skp1蛋白有望成為中晚期(II+III)NSCLC患者診斷和預后的生物標志物和治療靶點。