原花青素對Aβ25-35介導的tau蛋白過度磷酸化及p38 M APK信號通路的影響

王 旭，張小強，*，劉 靜，陳姚姚，盧曉星，苗歆雨

(1．東南大學公共衛(wèi)生學院，江蘇 南京

210009；2．東南大學環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009）

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種起病隱匿的進行性發(fā)展的神經系統(tǒng)退行性疾病[1]。AD的主要病理特征包括老年斑和神經元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)。Tau蛋白是一種微管相關蛋白，過度磷酸化的tau蛋白與微管蛋白的結合能力降低，進而在細胞內相互聚集成雙螺旋樣纖維(PHFs)，導致NFTs的形成[2]。雖然由β淀粉樣前體蛋白水解而來的β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)毒性曾被認為在AD發(fā)展中起主要作用，但近來越來越多的證據(jù)卻表明過度磷酸化的tau蛋白在AD等神經退行性疾病中發(fā)揮著關鍵作用[3]。氧化應激是AD的一個重要發(fā)病機制，Aβ的產生和聚集與其關系緊密。Aβ通過多條途徑誘導活性氧的產生，并可作用于多靶點加劇氧化應激，從而導致線粒體損失，進一步引起tau蛋白的高度磷酸化，導致神經元結構改變，最終造成AD的發(fā)病[4-5]。而由于磷酸酯酶和蛋白激酶活性的失調，使正常的tau蛋白喪失與微管結合能力造成微管不穩(wěn)定，進一步導致神經元功能障礙，神經變性至最終的功能缺陷[6]。其中絲裂原活化蛋白激酶(miotgenactivated protein kinase，MAPK)是tau蛋白過度磷酸化的關鍵性激酶，其中p38 MAPK (p38 miotgenactiveted protein kinase)是其中的重要組成部分。研究顯示激活p38 MAPK可引起神經系統(tǒng)tau蛋白的過度磷酸化[7]。

原花青素(proanthocyanidins，PC)是一種生物學功能廣泛的多酚類化合物，具有極強的抗氧化活性。目前已有一些研究發(fā)現(xiàn)PC可有效改善AD大鼠海馬組織中由Aβ沉積所導致的神經損傷，但國內外學者在PC對tau蛋白過度磷酸化的作用及其作用機制方面的關注相對較少[8-9]。本實驗利用β-淀粉樣蛋白25-35片段(Aβ25-35)誘導SH-SY5Y細胞構建模型，使用原花青素進行干預并探討其對tau蛋白過度磷酸化及p38 MAPK信號通路的影響，以期更好地明確其生物學作用。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑

原花青素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Aβ25-35、四甲基噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide， MTT)、 二 甲 基 亞 砜 (dimethylsulphoxide，DMSO)均購自Sigma-Aldrich公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購買于Thermo Fisher公司；胎牛血清購于Clark Bio公司；人成神經母細胞瘤SHSY5Y細胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；Bradford蛋白含量檢測試劑盒購于江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司；微量丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Tau、p-Tau(Ser396)、p38、p-p38、SB203580阻斷劑及actin一抗和二抗、Western blot化學發(fā)光試劑盒均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 主要儀器

Series 8000恒溫培養(yǎng)箱，購于Thermo Scientific公司；IX51倒置顯微鏡購自Olympus公司；5417R高速冷凍離心機購自Eppendorf AG公司；RT-6000酶標分析儀購自Rayto公司；Sonicator 4000超聲破碎儀，購于Misonix Inc公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將人成神經母細胞瘤細胞SHSY5Y培養(yǎng)于DMEM/F12完全培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素與100 mg/mL鏈霉素)，置于CO2體積分數(shù)為5%的37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，每2 d換液1次，每周傳代1次。

1.3.2 藥物配制 將20 mg原花青素溶于20 mL培養(yǎng)液中，制成終濃度為1 mg/mL的母液，分裝后置于-20℃保存。將冷凍干燥的1 mg Aβ25-35溶于965μL純水，制成1 mmol/L的母液，分裝，37℃恒溫箱孵育7 d，形成凝聚態(tài)后于-20℃保存；臨用前，將藥物稀釋至所需濃度。

1.3.3 MTT法檢測細胞存活率 細胞以5×104個/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，待細胞貼壁后進行分組，每組設5個復孔。在檢測原花青素對SH-SY5Y細胞存活率的影響時，分為調零組、對照組、不同濃度(0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL)原花青素干預組；在檢測Aβ25-35對SH-SY5Y細胞存活率的影響時，分為調零組、Aβ25-35對照組、不同濃度(0.1、1.0、2.5、10.0、20.0μmol/L)Aβ25-35染毒組；在檢測原花青素干預對Aβ25-35染毒的SH-SY5Y細胞存活率的影響時，分為調零組、對照組、1.0μmol/L Aβ25-35染毒組、不同濃度(0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL)原花青素+1.0μmol/L Aβ25-35處理組。調零組不含細胞，對照組細胞正常培養(yǎng)，處理組加入原花青素或和Aβ25-35后稀釋至指定濃度，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加5 mg/mL MTT溶液10μL，37℃孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀測定吸光度D(496)值，計算各組細胞存活率。

細胞存活率/%=[D(496)實驗組-D(496)調零組]/[D(496)對照組-D(496)調零組]×100%

1.3.4 硫代巴比妥法檢測細胞內MDA含量 將SHSY5Y細胞以6×105個/mL的濃度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，每皿1 mL，待細胞貼壁后，設對照組，1.0 μmol/L Aβ25-35染毒組，不同濃度(0.1、1.0、2.5和5.0 μg/mL)原花青素+1.0μmol/L Aβ25-35干預組。繼續(xù)孵育24 h后，以預冷PBS收集細胞，至冰水混合物中，超聲波勻漿共30 s細胞破碎，按試劑盒說明書檢測并計算各組樣本中MDA濃度。

MDA 濃度/(nmol/mg)=[D(532)測定值-D(532)對照值]/[D(532)標準值-D(532)空白值]×標準品濃度/待測樣本蛋白濃度

1.3.5 WST-8法檢測細胞內總SOD活力 細胞培養(yǎng)、分組及提取同1.3.4，分別在待測樣品和空白對照組中加入相應的WST工作液和酶工作液，于37℃中孵育20 min，并計算各組樣本的SOD抑制率及SOD活力。

1.3.6 Western blot檢測p-tau、tau、p38、p-p38蛋白表達水平 SH-SY5Y細胞以6×105個/mL的濃度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，分組同1.3.4。收集細胞，用RIPA裂解液提取蛋白，高速離心機4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA蛋白濃度試劑盒對蛋白進行定量。將蛋白進行凝膠電泳分離、轉膜、封閉、p-tau、tau、p38、p-p38一抗4℃孵育過夜，洗膜后二抗m-IgGκBP-HRP和山羊抗兔IgG-HRP孵育2 h，再次洗膜，最后加Western blot化學發(fā)光劑顯影，并用Image J軟件對灰度值結果進行分析。使用同樣的方法分別檢測對照組、Aβ25-35染毒組、SB203580組、Aβ25-35+SB203580組、Aβ25-35+5.0 μg/mL原花青素干預組的p-tau、tau、p38、p-p38的蛋白表達情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗結果以xˉ±s表示，應用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，方差齊時采用LSD-t檢驗，不齊時采用Dunnett-T3檢驗，以α=0.05為檢驗水準。線性相關分析結果用相關系數(shù)r表示。

2 結果

2.1 不同濃度的原花青素對細胞存活率的影響

MTT實驗結果如圖1，與對照組相比，0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL原花青素單獨作用下，對SH-SY5Y細胞存活率的影響差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。該結果表明本實驗所用劑量范圍內，原花青素對SH-SY5Y細胞無明顯毒性作用。

圖1 原花青素對SH-SY5Y細胞存活率的影響

2.2 不同濃度Aβ25-35對SH-SY5Y細胞存活率的影響

MTT實驗結果如圖2。與對照組相比，不同濃度Aβ25-35均使SH-SY5Y細胞活力降低(P＜0.05)。后續(xù)實驗選擇1.0μmol/L Aβ25-35染毒細胞建立細胞損傷模型。

圖2 不同濃度Aβ25-35對SH-SY5Y細胞存活率的影響

2.3 原花青素干預對Aβ25-35染毒SH-SY5Y細胞存活率的影響

MTT實驗結果如圖3。與染毒組(1.0μmol/L Aβ25-35)相比，原花青素干預24 h后，細胞存活率呈不同程度升高，其中0.1、1.0、2.5、5.0μg/mL原花青素干預組與Aβ25-35組及對照組間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.01)。

圖3 原花青素對Aβ25-35染毒細胞存活率的影響

2.4 原花青素對Aβ25-35染毒SH-SY5Y細胞氧化應激水平的影響

原花青素對Aβ25-35染毒細胞MDA和SOD水平的影響如表1所示，可見，與對照組相比，1.0μmol/L的Aβ25-35使細胞內MDA含量明顯增高，而細胞SOD活力明顯降低。隨著原花青素濃度的升高，MDA水平呈現(xiàn)不同程度的下降，而SOD水平則呈不同程度升高。其中，1.0、2.5、5.0μg/mL的原花青素促進細胞SOD活力增強(P＜0.05)，5.0μg/mL的原花青素使細胞MDA生成減少(P＜0.01)，而5.0μg/mL的原花青素可逆轉Aβ25-35誘導改變的MDA水平，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1不同濃度原花青素對Aβ25-35染毒細胞中MDA濃度和SOD活力的影響

2.5 原花青素對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響

Western blot法檢測結果如圖4所示。與對照組比較，給予Aβ25-35(1.0μmol/L)刺激，SH-SY5Y細胞ptau蛋白表達升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與1.0 μmol/L Aβ25-35組相比，原花青素(1.0、2.5、5.0μg/mL)預處理SH-SY5Y細胞，p-tau(Ser396)蛋白表達下調(P＜0.05)，且磷酸化水平呈劑量依賴性降低(r=0.755，P＜0.05)。

圖4 原花青素對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的影響

2.6 原花青素對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞p38蛋白磷酸化的影響

Western blot法檢測原花青素對Aβ25-35染毒細胞p38 MAPK通路的影響結果如圖5所示。與對照組比較，給予Aβ25-35(1.0μmol/L)刺激，SH-SY5Y細胞pp38蛋白表達升高(P＜0.05)。與1.0 μmol/L Aβ25-35組相比，原花青素(1.0、2.5、5.0μg/mL)預處理SH-SY5Y細胞，p-p38蛋白表達下調(P＜0.05)，且磷酸化水平呈劑量依賴性降低(r=0.768，P＜0.05)。

2.7 原花青素通過p38 MAPK通路抑制Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化

應用SB203580阻斷劑對p38、tau蛋白及其磷酸化水平影響的結果如圖6所示。與對照組相比，單獨應用阻斷劑組并未改變p-p38、p-tau(Ser396)蛋白表達水平(P＞0.05)。Aβ25-35誘導組可顯著上調 p-p38、p-tau(Ser396)蛋白表達(P＜0.05)。與 Aβ25-35染毒組比較，Aβ25-35+SB203580組的p-p38、p-tau(Ser396)蛋白水平明顯下調，Aβ25-35+5.0μg/mL原花青素干預組的p-p38、p-tau(Ser396)水平也明顯下降(P＜0.05)。

圖5 原花青素對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞p38蛋白磷酸化的影響

圖6 p38在原花青素抑制Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化的作用

3 討論

Tau蛋白是一種可溶性微管相關蛋白，在促進微管組裝和維護微管穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用，在神經元中表達，其主要定位于軸突。微管蛋白裝配成微管后，tau蛋白與原纖維絲保持垂直的狀態(tài)結合，減少微管的彈性，增加微管的穩(wěn)定性[10]。然而，在AD患者中觀察到tau蛋白磷酸化水平的過度升高，使其與微管的結合能力降低，從而互相聚集形成具有神經毒性的神經元纖維纏結，進而通過異常復雜的機制誘發(fā)神經元變形最終引發(fā)老年癡呆[11]。在Aβ刺激下，過度磷酸化的tau蛋白在成對螺旋絲上急劇增加，進一步導致細胞骨架失穩(wěn)和記憶功能障礙[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ刺激tau蛋白過度磷酸化的機制與Aβ引發(fā)氧化應激效應相關[13-14]。Aβ的神經毒性由氧自由基和氧自由基清除劑來介導和調節(jié)，過度聚合的Aβ?lián)p害神經細胞，并促使氧自由基生成增加，而抗氧化物質SOD水平下降，MDA水平上升，SOD是重要的氧自由基清除劑之一。

本研究顯示首先利用Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞建立體外AD模型，給予原花青素干預來檢測氧化應激水平，結果顯示原花青素可明顯升高抗氧化物質SOD的水平，且降低MDA的水平。氧化應激所導致的RCAN1酶水平增加，這種鈣調磷酸酶調節(jié)蛋白會促使Tau蛋白磷酸化。

本研究顯示原花青素可通過抑制Ser396位點tau蛋白的過度磷酸化來保護SH-SY5Y細胞免于Aβ介導的神經毒性。據(jù)相關研究發(fā)現(xiàn)，tau蛋白在Ser396位點處的過度磷酸化可引起成對螺旋絲狀AD樣聚集體和微管細胞骨架的不穩(wěn)定，并會誘導凋亡細胞的死亡和區(qū)域特異性神經變性[15]。因此，原花青素對該位點tau蛋白過度磷酸化的抑制可能與其發(fā)揮對神經的保護作用有關。

Tau蛋白發(fā)生過度磷酸化主要由體內蛋白激酶引起，其中絲裂原活化蛋白激酶(miotgen-activated protein kinase，MAPK)作為一種脯氨酸蛋白激酶發(fā)揮著重要作用。體外試驗中證實，在Aβ處理后的神經元中，MAPK被激活，并引起tau蛋白過度磷酸化。p38是MAPK途徑的重要組成部分之一，本研究結果表明原花青素可抑制Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞p-p38蛋白表達水平，為了確認原花青素是否可通過p38 MAPK信號通路發(fā)揮抑制tau蛋白磷酸化作用，我們選擇p38 MAPK通路的特異性抑制劑SB203580進一步研究p38 MAPK信號通路在原花青素抑制Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞tau蛋白磷酸化中的作用。SB203580是廣泛應用于p38信號通路的阻斷劑。研究顯示p38阻斷劑的應用可顯著改善Aβ25-35介導的細胞神經毒性[16-17]，Aβ可激活p38 MAPK引起神經系統(tǒng)中tau蛋白的過度磷酸化[18]，那么是否可抑制p38 MAPK通路激活從而改善Aβ25-35介導的SH-SY5Y細胞tau蛋白的過度磷酸化。為此，我們進一步做了相關研究，發(fā)現(xiàn)單獨抑制劑組tau蛋白磷酸化水平無明顯改變，原花青素與p38阻斷劑應用組均可引起tau蛋白磷酸化水平的下調，且降低程度無明顯差異，所以p38 MAPK活性的調節(jié)可能對原花青素減輕Aβ誘導的tau蛋白過度磷酸化發(fā)揮著重要的調控作用。

本研究證實了原花青素對Aβ25-35介導的tau蛋白過度磷酸化來發(fā)揮神經保護作用，其可能是通過抑制p38 MAPK信號傳導途徑來實現(xiàn)，該結果提高了我們對原花青素具有神經保護作用的認知，為進一步研究老年神經退行性疾病的防治也提供了新思路。