耐多藥結核分枝桿菌對喹諾酮藥物的耐藥特性及分子機制的研究

石慶新 楊陽 蔡鶯鶯 周鐵麗

結核病是由結核分枝桿菌引起嚴重危害人類健康的傳染病。全球大約有1/3人口潛伏感染，其中5%～10%發展為結核病患者[1]。近年來，由于流動人口的增加、不規范治療、患者依從性低等原因導致耐多藥肺結核發生，也是結核病疫情上升的主要原因[2]。因此，預防和治療耐多藥肺結核成為結核病防治的關鍵。喹諾酮類藥物作為抗肺結核的二線藥物[3]，在耐多藥肺結核患者和（或）不能耐受一線抗結核藥物的肺結核患者治療中起非常重要作用。該類抗菌藥物具有抗菌譜廣、口服吸收好、價格低廉等優點，被廣泛應用于各種感染性疾病治療。由于喹諾酮藥物濫用，結核分枝桿菌對該藥物敏感性呈逐年下降趨勢，影響結核病患者的療效。本課題通過開展耐多藥結核分枝桿菌（MDRTB）對喹諾酮類藥物體外藥敏實驗和喹諾酮類藥物耐藥基因突變位點的檢測研究，了解MDRTB對喹諾酮類藥物耐藥特點及分子機制，為探索新一代氟喹諾酮類藥物如莫西沙星、加替沙星等治療MDRTB提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2016年1月至2018年3月臺州各縣市區臨床分離80株非重復MDRTB[溫嶺市第一人民醫院16株、臨海市第一人民醫院10株、臺州市第一人民醫院11株、臺州市立醫院8株、臺州恩澤醫療中心（集團）恩澤醫院8株、玉環市第一人民醫院9株、天臺縣人民醫院5株、三門縣人民醫院7株、仙居縣人民醫院6株]。納入標準：從臺州各縣市區診斷肺結核患者的痰標本中分離出利福平和異煙肼同時耐藥的結核分枝桿菌。根據對氧氟沙星的敏感性分為兩組：氧氟沙星耐藥結核分枝桿菌（RMDRTB）組40株和氧氟沙星敏感結核分枝桿菌（SMDRTB）組40株。

1.2 試劑與儀器 氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星（中國上海源葉生物技術有限公司）；細菌DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑盒、Extractor 36DNA提取儀（中國成都博奧生物有限公司）；Bio-Rad T100TMThermal Cycler PCR（美國 Bio-Rad公司）；細菌分散儀（中國廣東體必康生物科技有限公司）；質控菌株結核分枝桿菌H37Rv（ATCC27924）（中國藥品生物制品檢定所）。

1.3 微量孔Alamar Blue顯色法檢測最小抑菌濃度（MIC） 參照文獻[4]進行，在無菌分離管中加入0.9%氯化鈉溶液1.5ml，加入3～4周鮮培養物，把無菌分離管插入細菌分散儀分散，配成1.0MCF的菌懸液，約為3×107CFU/ml濃度菌液。用7H9肉湯將配制好的菌懸液稀釋25倍。在96孔微量無菌平板中，從A～H列的1～12孔中加入7H9肉湯溶液100μl，先分別把氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星粉劑配制成1 000 μg/ml藥物原液，然后稀釋到32μg/ml藥液，再把濃度為 32μg/ml藥液100μl加入第1孔，混勻后取出100μl，加入第2孔，同樣連續2倍稀釋至第10孔，第11孔為無藥物陽性對照孔，第12孔為無菌陰性對照孔。從A～H列的1～11孔加入菌懸液100μl。用封板膜密封，放入37℃孵育箱，第6天加入30μl無菌0.1g/L刃天青溶液，37℃孵育24h。如果第11孔呈粉紅色，則在其他各孔中加顯色液，37℃孵育24h，記錄觀察結果；如果第11孔為藍色，在第9和11天繼續觀察。藍色不變色孔的藥物濃度為菌株的MIC值。根據參考文獻[5-6]，氧氟沙星、左旋氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星對結核分枝桿菌的MIC 判 斷 折 點 分 別 為 2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml 和0.5μg/ml，4種藥物對結核分枝桿菌MIC值分別大于各自MIC判斷折點為耐藥，4種藥物對結核分枝桿菌MIC值分別小于等于各自MIC判斷折點為敏感。

1.4 引物設計 參照文獻[7]設計引物，gyrA基因上游引物為 5′-CCGGATCGAACCGGTTGACAT-3′，下游引物5′-GGGCTTCGGTGTACCTCAT-3′，擴增gyrA基因耐藥決定區片段長度為358bp；gyrB基因上游引物為5′-AACACCGAGGTCAAATGGTT-3′，5′-CTGAATGCCGTCTTC CTTGTTGT-3′，擴增gyrB基因耐藥決定區片段長度為695bp。引物由上海鉑尚生物科技有限公司合成。

1.5 核酸提取 先加入80μl DNA提取液于提取管，加入20μl上述的菌懸液，放入Extractor36 DNA提取儀，振蕩 10min，95℃金屬浴 15min，12 000 r/min離心1min。

1.6 基因擴增 PCR的反應體系為30μl：包括rTaq 0.15μl，dNTP 0.5μl，PCR buffer 2.5μl，引物 2μl，模板 1μl，雙蒸水23.85μl。放入Bio-Rad T100TMThermal Cycler PCR儀中進行擴增。擴增實驗的條件：預變性94℃5min；變性95℃ 30s、退火55℃ 30s、延伸72℃ 2min進行35個循環；終延伸72℃10min。

1.7 序列測定 PCR產物送上海鉑尚生物科技有限公司測序。

1.8 統計學處理 采用Whonet5.6統計軟件分析結核分枝桿菌對喹諾酮類藥物的敏感性和MIC50數據；采用Alignment軟件對標準菌株和臨床菌株測序結果進行比對分析。

2 結果

2.1 喹諾酮類藥物對結核分枝桿菌的MIC SMDRTB組結核分枝桿菌對氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的敏感率均為100%。RMDRTB組結核分枝桿菌對氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星敏感性分別為0%、30.0%、42.5%和40.0%。氧氟沙星低濃度（MIC≤4μg/ml）耐藥RMDRTB組結核分枝桿菌對左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星敏感率分別為46.7%、80.0%和73.3%。兩組結核分枝桿菌對4種喹諾酮類藥物的敏感率和MIC分布見表1。

2.2 耐多藥結核分枝桿菌gyr基因的序列分析MDRTB通過測序與標準菌株H37Rv序列進行比對，在RMDRTB組中發現有33株gyrA基因發生突變，突變率為 82.5%，gyrA基因 Ala90Val突變 7株，Ser91Pro突變8株，Asp94Gly突變 12株，Asp94His突變 2株，Asp94Asn突變2株，Asp94Ala突變2株；發現有2株gyrB基因發生突變，突變率為5%，這2株gyrB基因株均與gyrA基因同時發生突變，突變類型為Thr478Asn+Asp94Gly和Asn477Thr+Asp94Gly；在SMDRTB組未發現gyr基因發生突變。gyrA基因部分位點的突變測序結果圖見圖1。氧氟沙星與左旋氧氟沙星耐藥菌株檢測到Ala90Val、Asp94Ala、Asp94His等 7 種gyr基因突變類型；莫西沙星和加替沙星耐藥菌株檢測到5種gyr基因突變類型。

表1 80株MDRTB對喹諾酮類藥物的MIC

圖1 結核分枝桿菌質控菌株H37Rv與臨床菌株的gyrA基因的測序比對[a：質控菌株（H37Rv）部分gyrA基因測序圖；b：臨床菌株gyrA基因Ala90Val（GCG→GTG）突變測序圖；c：臨床菌株gyrA基因 Ser91Pro（TCG→GTG）突變測序圖；d：臨床菌株gyrA基因Asp94Gly（GAC→GGC）突變測序圖]

2.3 40株RMDRTBgyr基因突變類型和氧氟沙星的MIC分布gyrA基因Ala90Val、Asp94Ala及Asp94His突變菌株氧氟沙星的 MIC 范圍 4～8μg/ml，MIC50為 4μg/ml。gyrA基因Ser91Pro突變菌株氧氟沙星的MIC范圍4～16μg/ml，MIC50為 8μg/ml。gyrA基因 Asp94Asn 突變菌株氧氟沙星的 MIC 范圍 8～16μg/ml，MIC50為 8μg/ml。gyrB基因與gyrA基因同時發生突變2株菌氧氟沙星的 MIC 為 16μg/ml，MIC50為 16μg/ml。未發生突變的RMDRTB 菌株氧氟沙星的 MIC 范圍 4～16μg/ml，MIC50為4μg/ml。40株RMDRTBgyr基因突變類型和氧氟沙星的MIC分布見表2。

3 討論

近年來，在治療結核分枝桿菌感染過程中出現了對三代氟喹諾酮藥物類耐藥的現象。據報道，各地區結核分枝桿菌對喹諾酮類藥物存在不同程度的耐藥[8]。本研究通過檢測喹諾酮類藥物對MDRTB的MIC值，發現氧氟沙星低濃度耐藥的MDRTB對莫西沙星和加替沙星敏感性高于左氧氟沙星，與國內外報道一致[9-10]。提示氧氟沙星與左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星存在一定程度的交叉耐藥。莫西沙星和加替沙星所顯示出更好抗菌活性是因為其結構中甲氧基取代C-8位上的氫原子，莫西沙星還具有較低的防突變濃度[11]。根據文獻報道，莫西沙星和加替沙星與一線藥物聯合使用在治療復發和耐多藥的結核患者具有良好的效果[12]。體內外的研究表明莫西沙星對氧氟沙星低濃度耐藥MDRTB和SMDRTB有很好的殺菌作用，莫西沙星可以作為治療氧氟沙星低水平耐藥的耐多藥肺結核患者推薦藥物。

氟喹諾酮類抗菌藥物作用于結核分枝桿菌的靶位是DNA旋轉酶（Ⅱ型拓撲異構酶），主要是通過阻止DNA的復制導致死亡。DNA旋轉酶是由gyrA基因編碼的兩個A亞基和gyrB基因編碼的兩個B亞基組成的四聚體。結核分枝桿菌對喹諾酮類藥物產生耐藥的主要分子機制是gyr基因中喹諾酮耐藥決定區發生突變。本研究檢到gyrA基因突變率為82.5%，與文獻報道接近[13]。結核分枝桿菌gyrA耐藥決定區突變類型存在于88-94位密碼子，其中最常見是94位密碼子Asp，Asp可被Gly、Asn、Ala、His和 Tyr等 5種氨基酸替換[8]。在本實驗中檢測到gyrA94位密碼子Asp被前面4種氨基酸取代突變類型。實驗中還檢到2株RMDRTB發生gyrB基因突變，gyrB的基因突變比gryA基因突變發生率低得多，與國內外的文獻報道一致[5，9，12]。相關研究表明gyrB突變使氟喹諾酮耐藥表型的檢出率提高了12%[14]。雖然結核分枝桿菌gyrB基因的突變率很低，但與喹諾酮類藥物耐藥也密切相關，也不能忽略。

表2 40株RMDRTB gyr基因突變類型和氧氟沙星的MIC分布

本研究數據表明：RMDRTB的gyrA基因Ser91Pro和Asp94Asn位密碼子的突變與喹諾酮類藥物高水平耐藥相關；gyrA基因 Ala90Val、Asp94His和 Asp94Ala位密碼子的突變與喹諾酮類藥物低水平耐藥相關，與文獻報道一致[15]。RMDRTB在gyrA和gyrB基因同時發生突變比gyrA基因單獨突變時的氧氟沙星抑菌濃度上升2～4倍，提示兩個基因同時突變可能與喹諾酮類藥物高水平耐藥相關，與文獻研究結果一致[10]。gyr不同突變位點與耐藥水平相關，可能是由于基因位點突變后轉錄翻譯成蛋白結構發生改變，影響喹諾酮類藥物與DNA解旋酶結合的穩定程度，影響耐藥水平。在分子檢測過程中考慮gyr基因突變組合可以提高預測氟喹諾酮耐藥表型的準確性。本研究有7株RMDRTB的gyrA和gyrB基因耐藥決定區未檢測到突變位點，突變位點可能發生在篩選的耐藥決定區域之外的突變的gyr基因和在其它基因上，如MFPA（Rv3361c），或主動外排泵RV2686c-Rv2687c-Rv2688c操縱子，與喹諾酮類藥物耐藥相關[13]。其MIC50為4μg/ml，可能與喹諾酮類藥物低水平耐藥相關，由于檢測數量少和突變位點未檢測，需要增加標本數量和進一步研究確定其他相關的分子耐藥機制。

綜上所述，莫西沙星在體外對氧氟沙星低濃度耐藥MDRTB和SMDRTB活性高于氧氟沙星、左旋氧氟沙星、加替沙星喹諾酮藥物，gyr基因突變對莫西沙星敏感性的影響小于左旋氧氟沙星和加替沙星，莫西沙星可以作為臨床治療氧氟沙星低水平耐藥的MDRTB患者首選藥物。