血小板抗體對早期流產和新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜的預測價值

謝一唯 王瑩 李育 蔣璐茜

血小板抗體是機體對血小板表面或相關抗原產生免疫，導致血小板破壞的抗體總稱，包括人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）抗體和人類血小板抗原（human platelet antigen，HPA）抗體兩大類，其產生多與妊娠、輸血或器官移植等免疫因素有關。早期流產是指妊娠12周內，在無外界干預的情況下發生的流產。組織學明確的早期流產發生率約為10%～15%[1]。在婦產科學中，若妊娠時發生母嬰血小板血型不合的免疫，可導致早期流產和新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜（neonatal alloimmune thrombocytopenia purpura，NAITP），NAITP是新生兒期較常見且嚴重的血液系統疾病，在危重新生兒中的發病率占20%～40%。因胎兒繼承與母體不合的父源血小板血型抗原，有些能夠刺激母體內產生特異性抗體，此類IgG抗體可通過胎盤進入胎兒體內，致敏胎兒血小板，使之破壞，導致胎兒或新生兒血小板減少，進而發生早期流產或NAITP，嚴重時可出現中樞神經系統出血、急性顱內出血、腦水腫和內臟出血而死亡。因此，血小板抗體篩選試驗對于有早期流產史的婦女來說非常重要，可對其造成流產的原因作出輔助診斷，預防NAITP的發生，確保優生優育，現已受到國內外專家的高度重視。為進一步明確血小板抗體與早期流產的相關性，及血小板抗體效價水平預測NAITP的準確性，筆者對175例有早期流產史的婦女，進行了固相凝集法血小板抗體檢測和研究，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 將我院2015年3月至2018年6月收治曾有早期流產史的婦女175例作為觀察組，年齡20～39（29.4±3.5）歲；其中自然流產1次95例，2次49例，3次及以上31例。并將同期在我院生產的2 537例正常孕婦作為對照組，年齡 21～37（28.2±3.2）歲。兩組紅細胞不規則抗體結果均為陰性，均無輸血史，IgG抗-A、抗-B效價均＜1∶64。兩組孕婦的年齡比較差異無統計學意義。

1.2 NAITP診斷與排除標準 NAITP的診斷主要依據其臨床特征和實驗室檢查。凡新生兒出生24h內出現嚴重的血小板減少癥，PLT＜150×109/L，臨床表現為皮膚黏膜瘀點、瘀斑及其他部位出血，血小板減少無其他醫學原因可以解釋，即可診斷為NAITP。排除標準：輸注隨機供者血小板后即刻出現血小板數量升高者[2-3]。

1.3 試劑與儀器 固相凝集法血小板抗體檢測試劑盒、平板式離心機均由長春博德生物技術有限公司提供。

1.4 檢測方法 采集受檢者靜脈血液標本3ml，采用乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝，3000r/min離心5min，留取上清液。血小板抗體檢測采用固相凝集法，嚴格按照血小板抗體檢測試劑盒說明書進行操作和判讀結果。紅細胞平鋪在反應孔底部或紅細胞只結合至部分孔底為結果陽性；紅細胞全部聚集在反應孔底部中央為結果陰性。將受檢者血漿進行1∶2～1∶256的倍比稀釋后再進行血小板抗體的效價水平檢測，結果判讀同上。

1.5 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計數資料的比較采用χ2檢驗；計算相對風險（RR），評估血小板抗體與早期流產的發病關系；繪制ROC曲線，計算AUC、靈敏度、特異度及最佳截斷值，評價血小板抗體效價水平預測NAITP的準確性，AUC＞0.9為準確性較高，0.7～0.9為有一定的準確性，0.5～0.7為準確性較低，＜0.5為無價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血小板抗體檢測結果的比較 觀察組175例中血小板抗體陽性者為34例（19.43%），對照組2537例中血小板抗體陽性者為74例（2.92%），觀察組血小板抗體陽性率明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 觀察組不同流產次數患者血小板抗體與陽性率的分布 觀察組175例早期流產婦女的血小板抗體，按流產次數分為3組，其中流產1次95例，血小板抗體陽性12例（12.63%），流產 2次 49例，陽性10例（20.41%），流產3次及以上31例，陽性12例（38.71%）。隨著流產次數的增加，血小板抗體陽性率逐漸增高，差異有統計學意義（χ2=10.20，P＜0.05）。

2.3 血小板抗體與早期流產的關系 兩組血小板抗體陽性的108例中有早期流產史34例，無早期流產史74例，患病率31.48%；血小板抗體陰性的2 604例中有早期流產史141例，無早期流產史2 463例，患病率5.41%，差異有統計學意義（χ2=116.73，P＜0.01），RR=5.82，說明血小板抗體陽性者發生早期流產的風險為血小板抗體陰性者的5.82倍，血小板抗體陽性者患病率顯著增高。

2.4 血小板抗體效價水平對NAITP發病的預測價值血小板抗體效價用于預測NAITP時，AUC為0.802，最佳截斷點為1∶32，診斷準確度中等，表明效價水平在1∶32時具有良好的預測價值，該截斷點用于診斷時靈敏度 0.714，特異度 0.854，P=0.008，95%CI：0.614～0.990；提示如果效價≥1∶32，新生兒發生NAITP的可能性較大，其水平在一定程度上可預測NAITP的發生（圖1）。

圖1 NAITP患者血小板抗體效價預測的ROC曲線

3 討論

血小板血型抗原主要有兩大類，即血小板相關抗原和血小板特異性抗原。血小板表面存在的與其它細胞或組織共有的抗原，稱為血小板相關抗原，包括組織相容性抗原和紅細胞血型系統相關抗原，如ABO血型抗原；由血小板特有的抗原決定簇組成，表現出血小板獨特的遺傳多態性，并且不存在于其它細胞和組織上的抗原稱為血小板特異性抗原[4]。血小板抗體是由血小板特異性抗原或HLA抗原通過輸血、妊娠等免疫刺激而產生。

現代臨床研究顯示，血小板抗體是造成同種免疫性血小板減少癥的直接原因。血小板輸注無效（PTR）、輸血后紫癜（PTP）、NAITP等疾病均與人類血小板同種抗原導致的血小板同種免疫有關，而HPA的免疫與不同人群中HPA抗原的分布頻率有關，若HPA系統中不配合的對偶抗原比例越高，則產生抗體的概率就越高[5]。Raghupathy等[6]將正常經產婦與有不明原因習慣性流產史的婦女對胎盤抗原反應性進行比較，證明正常妊娠時胚胎中與母親不合的父源性抗原可刺激母體免疫系統發生Th2反應，從而產生HLA抗體、血小板抗體、紅細胞抗體和各種細胞因子抗體等。由于不同個體間免疫反應存在差異，因此不同孕婦妊娠時會產生不同的抗體，且隨著妊娠次數的增加產生某種抗體的概率也相應增加。

本研究結果表明，有早期流產史者血小板抗體陽性率顯著高于正常孕婦，差異有統計學意義，且血小板抗體陽性者發生早期流產的風險較血小板抗體陰性者高。隨著流產次數的增加，血小板抗體陽性率逐步增高，兩者呈正比關系。

近年來研究發現，妊娠期婦女免疫功能發生相應變化，體液免疫功能增強，細胞免疫被抑制，這種變化有利于胚胎保護。然而，母體免疫功能紊亂對妊娠造成不利影響。母嬰間血型不合引起的同種免疫是孕婦不明原因流產的主要因素[7]。流產可發生在早期（孕4個月左右）也可發生在晚期（孕8個月左右）。母嬰間紅細胞血型抗體不合是導致晚期習慣性流產的主要原因，而因血小板在妊娠早期比紅細胞更容易進入母體血液循環中，母嬰間血小板血型不合的血小板抗體（包括HPA抗體和HLA抗體）是導致早期流產及NAITP的主要原因。反復多次妊娠可使HPA和HLA-I類抗原刺激機體產生同種免疫反應，妊娠次數與同種免疫有密切關系，這些抗體主要是由先前的妊娠免疫刺激母體所產生。lgG抗體由于分子量小，在妊娠早期（約14周）就能通過胎盤屏障進入胎兒血液循環，使胎兒血小板破壞，導致孕婦早期流產或NAITP[8-10]。在新生兒期，NAITP是第二常見的溶血性疾病，位居貧血之后，這是一種病死率較高的新生兒血小板減少癥，患病胎兒和新生兒可出現中樞神經系統和內臟出血、腦水腫，嬰兒出生時伴隨廣泛的瘀點和瘀斑，或2～3d后出現血小板減少癥狀，實驗室檢查顯示血小板顯著減少。

RAhya等[11]報道，NAITP主要與HPA多態性有關，在高加索人中，90%的NAITP是由HPA-la抗體引起，而且高于1∶32的抗體滴度與嚴重的血小板減少相關。目前NAITP主要是通過鑒定血小板抗原和檢測血小板抗體進行實驗室診斷。但在國內，對于該病的研究資料不夠豐富，臨床重視程度也不夠，孕婦產前檢查時很少有針對性地進行血小板血型相關的檢測，報道的NAITP多數是出現嚴重后果時才通過新生兒免疫血液學檢測而明確診斷。由于該病的病死率較高（達13%），因此，早期檢查、早期診斷并干預治療非常重要，可減少圍生兒的發病率及死亡率。應注意血小板抗體的檢測結果，發現抗體效價高的可及早進行藥物治療或血漿置換治療。本研究的ROC曲線結果顯示，AUC為0.802，通常來說，當AUC在0.8～0.9時，可認為該指標具有較好的預測價值及準確性。因此，上述研究結果提示利用血小板抗體效價預測NAITP時，若效價≥1：32，則新生兒發生NAITP的可能性較大，其水平可在一定程度上預測NAITP的發生。對于NAITP風險較高的孕婦，可通過靜脈注射免疫球蛋白（IVIG）或聯合使用IVIG與糖皮質激素進行產前治療，以減少NAITP和顱內出血的風險[6]。但因目前的研究數量較少，需進一步加大樣本量及進行多中心研究來確定其臨床應用價值，如果增加樣本數量，仍獲得較好的臨床預測效果，血小板抗體結果有望作為非侵入性預測NAITP的指標，指導臨床進行早期干預和治療[12]。

目前國內外臨床上檢測血小板抗體的方法主要有功能性試驗、酶標法、熒光法及固相凝集法4類方法[13-14]，但大多數方法試劑昂貴，操作步驟復雜，因而實驗室檢測受到局限。傳統方法采用甲醛固定血小板，導致其抗原結構破壞，有可能漏檢某些抗體，而固相凝集法將抗人血小板單克隆抗體與完整血小板結合，并使其固定在反應孔底部，避免了出現漏檢的可能。該方法能同時檢測HLA抗體和HPA抗體，操作簡便，無需特殊儀器，且1h內可完成檢測。其穩定性、靈敏度與特異性均較好，不僅可手工小量操作，也可上機進行大規模檢測，能滿足各級醫療單位的臨床應用。

血小板抗體陽性者，患者發生流產、死胎、不孕不育、NAITP等相應疾病的風險較大。建議臨床采取干預和治療措施，如IVIG、糖皮質激素等；可疑陽性者，要對患者給予風險提示，告知下次妊娠可能會導致血小板抗體強度增強，從而引起相關疾病。可建議患者以中醫調理為主；血小板抗體陰性，基本可排除由血小板抗體引起相關疾病的可能。

綜上所述，血小板抗體篩選對有反復多次早期流產史婦女尤為重要，它可作為預測高危妊娠是否流產的一種較為敏感的指標，是無創性評估的較好方法，為流產的早期診斷治療提供了重要的實驗室依據，可提前預判孕婦發生早期流產的風險。它能有效地探討早期流產的病因、早期預測及預防NAITP的發生，能更好地服務于臨床，指導臨床醫生做好孕前干預、孕期篩查治療和風險評價工作，必要時可對孕婦進行IVIG、糖皮質激素等治療，從而提高優生優育的水平。而且，隨著分子生物學檢測的發展，筆者相信，其也能預測免疫性胎兒或新生兒疾病的發生與否，與血清學結果進行相互印證，為臨床防治提供相應的佐證條件。關于此方面的進展尚有進一步研究價值，其臨床應用價值還需擴大驗證。