FGA基因c.104G＞A雜合突變導致的先天性低纖維蛋白原血癥家系的基因分析

蘇正仙 畢曉潔 金先富 張慧斐 姜俊宇 沈波

纖維蛋白原（FIB）是參與機體止血的關鍵物質，具有多種功能，包括纖維蛋白凝塊的形成、與凝血酶的結合、介導血小板聚集反應等[1]。它存在于血漿中，由肝細胞分泌，分子質量為340kD，是通過29個鏈間和鏈內二硫鍵連接的兩組三個多肽（Aα、Bβ和γ）組成的完全六聚體[2]。六條鏈排列形成三叉結構，通過由包含兩個單獨三螺旋卷曲螺旋區域的2個遠端球形D結構域以及一個中心E區域組成。每條鏈的N末端有助于構成中心E區域，而Bβ和γ鏈的C末端和卷曲螺旋區域的一部分形成2個遠端球形D結構域[3]。形成FIB的3條多肽鏈（Aα、Bβ 和 γ）分別含有 610、461以及 411個氨基酸殘基，每條多肽則分別由相對應的不同基因參與編碼翻譯產生[4]。FIB基因缺陷可影響其FIB的表達，或明顯影響其表達產物與血小板糖蛋白、血漿凝血酶之間的結合位點，更有可能影響到FIB單體的聚合及其蛋白的穩定性，由此最終導致機體表現出與出血、凝血相關的一系列少見的病癥[5-6]。筆者回顧1例遺傳性低纖維蛋白原血癥患者家系的臨床資料，并通過基因測序來對其家系的發病機制進行初步研究。

1 資料和方法

1.1 一般資料 本例患者來自浙江臺州地區的先天性低纖維蛋白原血癥家系。先證者，男，49歲，患痔瘡、反復滲血前來本院就醫，發病原因不明。2016年5月患者行凝血功能檢查，結果FIB為0.68g/L，血常規顯示為缺鐵性低色素性貧血，且在1個月后凝血功能復查時FIB值仍處于嚴重低值，結合D-二聚體與FIB降解產物（FDP）結果，排除了原發及繼發性纖溶亢進后，結合家系咨詢，初步診斷為先天性低纖維蛋白原血癥。未發現該患者有腎臟疾病、肝炎肝硬化的發病歷史；此外其家族內部也從未有患腫瘤的病史等。為求進一步確診，筆者對該家系進行了基因測序。其家系圖譜見圖1。

圖1 先證者家系圖譜

1.2 方法

1.2.1 引物 根據FIB的基因序列設計29對引物[7]，包含FGA、FGB以及FGG基因的所有外顯子及其側翼序列和啟動子區，并送上海華大基因公司進行合成。

1.2.2 標本收集 采血前與其家系成員簽署相關的知情同意書。采集家系各成員外周靜脈血樣本兩份，一份按照1∶9的比例以0.109mmol/L的枸櫞酸鈉抗凝，行凝血相關數據的檢測；另一份常規血清分離，用于DNA的抽提，血樣本放置于-80℃的冰箱中冰凍保存。

1.2.3 凝血功能檢測與基因測序 將枸櫞酸鈉抗凝的血樣以3 000r/min離心10min，上層血漿運于檢測APTT、PT、FIB、TT、D-二聚體、FDP（法國 STA-R 全自動血凝分析儀以及其配套試劑），FIB抗原含量采用免疫比濁法測定（雅培c16000全自動生化分析儀及其配套試劑）。另將分離出的血清用于肝腎功能檢測（雅培c16000全自動生化分析儀以及其配套試劑）。用采集的全血標本進行DNA抽提，經PCR擴增后外送上海華大基因檢測公司進行測序，測序結果與NCBI GenBank中FIB所對應的基因測序數據做最終地比較分析，并用反向測序予以驗證突變位點。

1.2.4 生物信息學工具 采用Polyphen-2（蛋白質ID：P02671）、MutationTaster（蛋白質轉錄本 ID：ENST00000 302053）兩種在線軟件分析FGA基因第2外顯子c.104G＞A的錯義突變對FGA蛋白結構和功能的影響。

2 結果

2.1 肝功能、凝血項目檢測結果 先證者家系成員的肝功能項目檢查結果均顯示處于正常范圍，排除肝臟功能合成障礙引起的FIB缺陷。見表1。

表1 家系成員的檢測結果

2.2 基因檢測結果 基因測序結果見圖2，先證者FIBFGA基因第2外顯子發生c.104G＞A的堿基雜合點突變（密碼子CGT→CAT），導致Arg16His的雜合突變（16號精氨酸突變為組氨酸）。先證者的父親在該位點的測序結果與先證者一致，除此以外所有其它的基因測序結果都顯示為正常。

圖2 先證者FGA基因第2外顯子測序圖

2.3 生物信息學結果 兩種在線軟件預測結果一致，Pyolphen積分為1，預測結果為“PROBABLY DAMAGING”，MutationTaster積分為 0.9999，預測為“disease causing”。

3 討論

FIB是機體中含量最高的凝血因子，其在血漿中的正常濃度范圍為2.0～4.0g/L[8]。當外界創傷等引起血管出血時，FIB就會在血漿一系列凝血因子及相關酶類的催化作用中轉變成為纖維蛋白，大量纖維蛋白縱橫交叉呈網狀，結合血小板形成微血栓達到止血的目的[9]，不同原因導致的FIB含量或者活性降低都有可能會導致機體出凝血功能上的一系列障礙，引起出血難止亦或者纖溶激活障礙導致血栓栓塞，最終可能危及生命。

20世紀終末期，Terasawa等[10]首次發現低纖維蛋白原血癥存在的具體基因缺陷-雜合的γCysl53Arg，之后陸續有文章報道新發現的突變位點，截止2017年1月人類基因突變數據庫已發現近300個突變位點，而FGA基因上就存在100多個突變位點，包括錯義/無義突變、剪切位點突變、小片段缺失等。

遺傳性低纖維蛋白原血癥臨床表現具有較大的異質性[11]，嚴重程度與FIB的突變位點及類型相關，同一突變也有可能有不同臨床表現。Stucki等[12]研究顯示Arg16His突變者無出血癥狀。而本文研究家系，先證者表現為痔瘡、反復滲血，FIB為0.68g/L，明顯低于正常水平，基因測序結果顯示FGA基因2號外顯子上存在c.104G＞A的錯義突變（密碼子CGT→CAT），即Arg16His的雜合突變。這一突變不僅可以導致FIB被凝血酶酶解時FPA釋放速度的減慢[13]，更嚴重的可能是此突變還可引起FIB被酶解過程中產生FPA總量的異常，凝血過程中交聯纖維蛋白產生量因此減少，導致FIB在機體血漿中的“量”和活性先天性下降的現象，本文推測導致該突變是導致該家系先證者反復滲血的主要原因。

綜上所述，本研究明確了FGAArg16His的突變是導致本研究家系遺傳性低纖維蛋白原血癥發生的分子機制。但是這其中所蘊含的具體機制則還需要進行深入的研究探索，對造成先天性低纖維蛋白原血癥的分子機制也同樣需要進一步地被闡明。目前，國內在先天性低纖維蛋白原血癥的相關研究取得了很大的進展，隨著檢測技術的逐漸進步完善，可以通過分析纖維蛋白溶解曲線、FIB凝固率檢測等方法[14]較準確地評估FIB功能，以此分析突變與疾病之間的關系[15]。目前該類疾病的治療仍以替代治療為主，基因治療是未來的發展趨勢[16]。