siRNA沉默ADAM10基因對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞凋亡的影響

王培，楚天舒，閻磊，劉冰，朱清，邵鳳民

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siRNA沉默ADAM10基因對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞凋亡的影響

王培，楚天舒，閻磊，劉冰，朱清，邵鳳民

450003 鄭州，河南省人民醫院風濕免疫科（王培、楚天舒），腎病科（閻磊、劉冰、朱清、邵鳳民）

探討小干擾 RNA（siRNA）沉默解整合素金屬蛋白酶（ADAM10）基因對類風濕關節炎滑膜成纖維細胞凋亡的影響。

將ADAM10 特異性 siRNA 轉染人類風濕關節炎滑膜成纖維細胞 MH7A 細胞，實驗分為 3 組，ADAM10-siRNA 組轉染 ADAM10 特異性 siRNA，NC-siRNA 組轉染 ADAM10 非特異性 siRNA，對照組為未經轉染處理的 MH7A 細胞。轉染 48 h后采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組細胞中 ADAM10 表達水平，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，qRT-PCR 檢測凋亡相關基因 B 細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和 Bcl-2 相關 X 蛋白（Bax）表達水平，ELISA 測定細胞培養上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-8（IL-8）含量。

ADAM10-siRNA 組細胞中 ADAM10 mRNA 和蛋白表達水平較 NC-siRNA 組和對照組低（< 0.05）。沉默 ADAM10 基因后，ADAM10-siRNA 組細胞凋亡率顯著高于 NC-siRNA 組和對照組（< 0.05）。ADAM10-siRNA 組細胞中 Bax 基因表達水平明顯高于 NC-siRNA 組和對照組（< 0.05），Bcl-2 基因表達水平明顯低于 NC-siRNA 組和對照組（< 0.05）。ADAM10-siRNA 組細胞分泌的 TNF-α、IL-6 和 IL-8 顯著低于 NC-siRNA 組和對照組（< 0.05）。而 NC-siRNA 組和對照組以上各指標相比較，差異不明顯（> 0.05）。

沉默 ADAM10 基因可明顯促進類風濕關節炎滑膜成纖維細胞的凋亡，并進一步減少 TNF-α、IL-6 和 IL-8 等炎癥因子的分泌，提示通過沉默 ADAM10 基因使減輕/控制類風濕關節炎炎癥成為可能。

關節炎，類風濕； 滑膜成纖維細胞； 解整合素金屬蛋白酶 10； 細胞凋亡

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以累及關節為主的慢性全身性系統性自身免疫疾病，其病理特征在于滑膜過度增生，炎性單核細胞浸潤，繼而造成關節炎癥、破壞及功能障礙[1]。越來越多的證據表明，RA 滑膜中存在高度活化的滑膜成纖維細胞（synovial fibroblasts，SFs），SFs 可通過產生促進軟骨破壞的促炎癥細胞因子（如TNF-α、IL-6 和IL-8 等）和蛋白酶在 RA 發生發展中發揮關鍵作用[2-3]。近期研究表明，類風濕關節炎滑膜成纖維細胞不但高度活化，釋放炎癥因子，并且存在凋亡受阻[4]。解整合素金屬蛋白酶 10（adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）屬于 ADAM 家族成員，是一種跨膜蛋白，參與多種炎性和退行性疾病的發生和發展[5-6]。先前的研究表明 ADAM10 在 RA 滑膜組織中過表達，且在 RA 的滑膜成纖維細胞的增殖及血管生成中起關鍵作用[7]。據報道，沉默 ADAM10 能夠抑制類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖、擴散、遷移和侵襲[8]。然而，ADAM10 是否介導類風濕關節炎滑膜成纖維細胞凋亡的研究鮮有報道。因此，本研究通過構建 ADAM10 特異性 siRNA，通過脂質體轉染人類風濕關節炎滑膜成纖維細胞 MH7A 細胞，觀察沉默 ADAM10 基因對 MH7A 細胞凋亡及對炎癥因子的影響，為揭示 RA 可能的機制及基因靶向治療提供可能的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

人類風濕關節炎滑膜成纖維細胞 MH7A 細胞株購自日本 RIKEN 生物資源中心；DMEM 培養基購自美國 Gibco 公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自美國 Hyclone 公司；ADAM10 特異性siRNA 及ADAM10 非特異性siRNA 購自上海吉瑪制藥有限公司；Lipofectamine 2000 脂質體轉染試劑、Trizol 試劑購自美國 Invitrogen 公司；M-MLV 逆轉錄試劑盒購自美國 Promega 公司；SYBR Primix Ex Taq 檢測試劑盒購自日本 Takara 公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 細胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；ADAM10 兔抗人單抗購自美國 Cell Signal 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TNF-α、IL-6、IL-8 ELISA 檢測試劑盒購自美國Bio-Techne 公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MH7A 細胞培養在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中，置 37 ℃、體積分數為 5% CO2的細胞培養箱中進行孵育，根據細胞生長狀態，每 2 天更換一次培養基，待細胞生長匯合率達 90% 時，使用胰蛋白酶消化傳代培養。

1.2.2 細胞轉染及分組 轉染前 24 h 將處于對數生長期的MH7A 細胞接種于 6 孔板中，放置于 37 ℃培養箱中繼續培養，當細胞生長匯合約 50% 時，根據Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書進行轉染操作，使用的 siRNA 終濃度為 40 nmol/L，將轉染ADAM10 特異性 siRNA 的 MH7A 細胞記為 ADAM10-siRNA 組，轉染 ADAM10 非特異性 siRNA的 MH7A 細胞記為 NC-siRNA 組，未進行轉染處理的 MH7A 細胞記為對照組。將轉染后的各組細胞置 37 ℃培養箱中繼續培養，48 h 后分別收集各組細胞及培養上清液。

1.2.3 qRT-PCR 檢測 分別收集轉染 48 h 后的各組MH7A 細胞，按照 Trizol 試劑說明書提取細胞中總 RNA，經蛋白核酸微量檢測儀測定 RNA 濃度和純度，選取260/280比值在 1.8 ~ 2.0 間的 RNA 進行逆轉錄，反應體系配置及反應程序設定均參照 M-MLV 逆轉錄試劑盒說明書進行，合成 cDNA。以 cDNA 為模板，采用 SYBR Primix Ex Taq 檢測試劑盒進行定量檢測，采用 20 μl 反應體系。反應采用 GAPDH 為內參，統計每孔 Ct 值，使用 2-ΔΔCt法分析各組細胞中ADAM10 mRNA 相對表達水平。引物：ADAM10 F：5' CTGCCCAGC ATCTGACCCTAA 3'，R：5' TTGCCATCAGAACTG GCACAC 3'；Bax F：5' GGGAGACACCTGAGCTG ACC 3'，R：5' GGACTCCAGCCACAAAGATGG 3'；Bcl-2 F：5' GAACTGGGGGAGGATTGTGGCC 3'，R：5' TCGACGTTTTGCCTGAAGACTGTTAA 3'；GAPDH F：5' ACCACAGTCCATGCCATCAC 3'，R：5' CCACCACCCTGTTGCTGTAG 3'。

1.2.4 Western blot 檢測 轉染 48 h 后收集各組 MH7A 細胞，加入 RIPA 細胞裂解液，于冰上提取細胞中總蛋白。以 BCA 蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，SDS 上樣緩沖液與蛋白按比例混合，在沸水浴中加熱 15 min 致蛋白變性，取 40 μg 蛋白樣品加到上樣孔中，行 SDS-PAGE 電泳，分離蛋白后以半干法轉移至 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉進行封閉 2 h。加入1:1000 稀釋的ADAM10 一抗，4 ℃過夜孵育。TBST 洗膜 15 min，洗滌3 次，加入1:3000 稀釋的二抗，室溫孵育 1 h。TBST 洗膜 15 min，洗滌3 次，加入 ECL 化學發光液顯色，轉移至暗室，曝光，以GAPDH 為內參，使用 Image J 圖像分析軟件統計分析，計算各組細胞中ADAM10 蛋白表達水平。

1.2.5 流式細胞儀檢測 各組 MH7A 細胞轉染48 h 后，以預冷的 PBS 洗滌細胞 2 次，離心收集細胞，加入 100 μl 結合緩沖液，重懸細胞，分別向細胞中加入Annexin V-FITC 和 PI 染液各5 μl，室溫避光反應 30 min，再向細胞中加入 400 μl 結合緩沖液，上流式細胞儀檢測，統計各組 MH7A 細胞凋亡率。

1.2.6 ELISA 檢測 各組 MH7A 細胞轉染 48 h 后，分別收集細胞培養上清液，根據 ELISA 檢測試劑盒說明書測定上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 水平。使用酶標儀測定在 450 nm 波長處吸光度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 轉染 siRNA 對 MH7A 細胞中 ADAM10 表達的影響

qRT-PCR 和Western blot 檢測結果見表 1 和圖 1，ADAM10-siRNA 組 MH7A 細胞中 ADAM10 mRNA 和蛋白表達水平相比 NC-siRNA 組和對照組均明顯下調（< 0.05）。NC-siRNA 組和對照組間 ADAM10 mRNA 和蛋白表達水平差異不顯著（> 0.05）。提示在 MH7A 細胞中轉染ADAM10-siRNA 能夠有效沉默 ADAM10 基因及抑制 ADAM10 蛋白表達。

表 1 轉染 48 h 后各組 MH7A 細胞中ADAM10 mRNA和蛋白水平比較（）

注：與對照組比，*< 0.05；與NC-siRNA 組比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

2.2 沉默 ADAM10 基因對 MH7A 細胞凋亡的影響

沉默 ADAM10 基因后采用流式細胞儀檢測各組 MH7A 細胞凋亡情況，結果顯示，ADAM10-siRNA 組細胞凋亡率相比NC-siRNA 組和對照組明顯升高（< 0.05）。NC-siRNA 組和對照組間細胞凋亡率差異不明顯（> 0.05），見表 2 和圖 2。說明沉默 ADAM10 基因能夠誘導 MH7A 細胞凋亡。

2.3 沉默 ADAM10 基因對 MH7A 細胞中 Bcl-2 和 Bax 蛋白表達的影響

采用qRT-PCR 檢測各組 MH7A 細胞中凋亡相關基因 Bcl-2 和 Bax 表達水平，結果如表 3 所示，ADAM10-siRNA 組細胞中 Bcl-2 mRNA 表達水平相比 NC-siRNA 組和對照組明顯下調（< 0.05），Bax mRNA 表達水平明顯上調（< 0.05）。NC-siRNA 組和對照組間 Bcl-2 和 Bax 基因表達水平差異無統計學意義（> 0.05）。提示沉默 ADAM10 基因能夠下調 Bcl-2 的表達，上調 Bax 的表達。

圖 1 Western blot 檢測各組 MH7A 細胞中 ADAM10 蛋白水平

Figure 1 Western blot analysis of ADAM10 protein levels in MH7A cells of each group

表 2 沉默 ADAM10 基因對 MH7A 細胞凋亡的影響（）

注：與對照組比，*< 0.05；與NC-siRNA 組比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

2.4 沉默 ADAM10 基因對 MH7A 細胞培養上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 含量的影響

采用ELISA 測定各組細胞培養上清液中TNF-α、IL-6 和 IL-8 含量，ADAM10-siRNA 組細胞上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 相比 NC-siRNA 組和對照組明顯降低（< 0.05）。NC-siRNA 組和對照組間細胞上清液中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 含量差異不明顯（> 0.05），見表 4。提示沉默 ADAM10 基因能夠抑制細胞分泌 TNF-α、IL-6 和 IL-8。

圖 2 流式細胞儀檢測各組 MH7A 細胞凋亡率

Figure 2 Flow cytometry to detect apoptosis rate of MH7A cells in each group

表 3 沉默 ADAM10 基因對 MH7A 細胞中 Bcl-2和 Bax 基因 mRNA 表達的影響（）

注：與對照組比，*< 0.05；與NC-siRNA 組比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

3 討論

目前已有大量研究證實，RA 患者滑膜中的滑膜成纖維細胞不但存在過度增殖，還存在凋亡不足[9-10]。因此，有效誘導滑膜成纖維細胞的凋亡，也可能是治療 RA 的方法之一。在 Isozaki 等[11]研究中，發現 ADAM10 在人 RA 滑膜成纖維細胞中的表達水平顯著升高；后續研究發現 ADAM10 在 RA 患者的滑膜組織及滑液中均呈高表達，沉默 ADAM10 能夠抑制類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖、擴散、遷移和侵襲，然而其是否能夠影響滑膜成纖維細胞的凋亡尚未可知。ADAM10 在乳腺癌、結直腸癌、口腔鱗狀細胞癌等常見惡性腫瘤中亦呈高表達[12]。Zhang 等[13]研究，通過轉染 siRNA 敲除肝癌細胞中 ADAM10 的表達，發現肝癌細胞凋亡增加。Fu 等[14]研究指出，ADAM10 可調節膀胱癌細胞增殖、侵襲、凋亡及化療耐藥。提示 ADAM10 可能參與細胞凋亡過程，因此，本實驗通過在人類風濕關節炎滑膜成纖維細胞 MH7A 細胞中轉染 ADAM10 特異性 siRNA，有效降低了 MH7A 細胞中 ADAM10 表達的水平。經流式細胞儀檢測發現，沉默 ADAM10 基因后，MH7A 細胞凋亡率顯著升高。qRT-PCR 檢測發現沉默 ADAM10 基因的 MH7A 細胞中 Bcl-2 mRNA 表達明顯降低，而 Bax mRNA 表達明顯升高。Bax 和Bcl-2 是細胞凋亡中研究最多、最透徹的基因，其中 Bax 是促凋亡基因，而 Bcl-2 是抑制細胞凋亡的基因[15]。本實驗結果發現沉默 ADAM10 基因后 Bax 表達升高，Bcl-2 表達降低，提示沉默ADAM10 基因可能通過調節 Bcl-2、Bax 的表達水平進而使滑膜成纖維細胞凋亡增加。這與近期Guo 等[16]研究結果一致—— miR-152 通過靶向 ADAM10 抑制類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖進而誘導細胞凋亡。

表 4 沉默 ADAM10 基因對 MH7A 細胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-8含量的影響（）

注：與對照組比，*< 0.05；與NC-siRNA 組比，&< 0.05。

Notes: Compared with the control group,*< 0.05; compared with the NC-siRNA group,&< 0.05.

眾多研究發現，RA 患者滑膜成纖維細胞能夠分泌包括 TNF-α、IL-6 和 IL-8 在內的多種炎癥因子，炎癥因子又可進一步促進滑膜成纖維母細胞的增生，兩者均參與 RA 的發生與發展，TNF-α 是熟知的參與 RA 發病機制的關鍵炎癥因子，使用 TNF-α 抑制劑治療 RA 在臨床上被證實是安全有效的[17]。此外，研究證實，IL-6 和 IL-8 在 RA 患者的血清和滑液中呈高濃度存在，在 RA 的發生發展中也起著關鍵作用，參與關節組織的破壞[18]。越來越多的證據表明 ADAM 家族參與炎癥反應的調節，該家族的成員可以作為治療炎性疾病（包括 RA）的新型治療靶點[19]。因此，本研究設想，是否可以通過沉默 ADAM10 基因影響類風濕關節炎滑膜成纖維細胞炎癥因子的分泌。結果顯示 ADAM10 可調節人類風濕性關節炎滑膜成纖維細胞分泌 TNF-α、IL-6 和 IL-8 等炎癥因子。因此，ADAM10 有可能作為治療RA 的新型治療靶標。

綜上，本實驗證實了 siRNA 沉默 ADAM10 基因能夠有效促進類風濕關節炎滑膜成纖維細胞的凋亡，減少炎癥因子釋放，提示 ADAM10 可能作為 RA 基因治療中的潛在作用靶點。

[1] Catrina AI, Joshua V, Klareskog L, et al. Mechanisms involved in triggering rheumatoid arthritis. Immunol Rev, 2016, 269(1):162-174.

[2] Hillen J, Geyer C, Heitzmann M, et al. Structural cartilage damage attracts circulating rheumatoid arthritis synovial fibroblasts into affected joints. Arthritis Res Ther, 2017, 19(1):40.

[3] Kashyap S, Kumar U, Pandey AK, et al. Functional characterisation of ADP ribosylation factor-like protein 15 in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Clin Exp Rheumatol, 2018, 36(4):581-588.

[4] Marotte H, Ahmed S, Ruth JH, et al. Blocking ERK-1/2 reduces tumor necrosis factor alpha-induced interleukin-18 bioactivity in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts by induction of interleukin-18 binding protein A. Arthritis Rheum, 2010, 62(3):722-731.

[5] Isozaki T, Ishii S, Nishimi S, et al. A disintegrin and metalloprotease-10 is correlated with disease activity and mediates monocyte migration and adhesion in rheumatoid arthritis. Transl Res, 2015, 166(3):244-253.

[6] Erin N, Türker S, Elpek ?, et al. ADAM proteases involved in inflammation are differentially altered in patients with gastritis or ulcer. Exp Ther Med, 2018, 15(2):1999-2005.

[7] Isozaki T, Rabquer BJ, Ruth JH, et al. ADAM-10 is overexpressed in rheumatoid arthritis synovial tissue and mediates angiogenesis. Arthritis Rheum, 2013, 65(1):98-108.

[8] Li D, Xiao Z, Wang G, et al. Knockdown of ADAM10 inhibits migration and invasion of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Mol Med Rep, 2015, 12(4):5517-5523.

[9] Seki M, Sakata KM, Oomizu S, et al. Beneficial effect of galectin 9 on rheumatoid arthritis by induction of apoptosis of synovial fibroblasts. Arthritis Rheum, 2014, 56(12):3968-3976.

[10] Qu Y, Wu J, Deng JX, et al. MicroRNA-126 affects rheumatoid arthritis synovial fibroblast proliferation and apoptosis by targeting PIK3R2 and regulating PI3K-AKT signal pathway. Oncotarget, 2016, 7(45):74217-74226.

[11] Isozaki T, Nishimi S, Nishimi A, et al. A disintegrin and metalloproteinase (ADAM)-10 as a predictive factor for tocilizumab effectiveness in rheumatoid arthritis. Mod Rheumatol, 2016, 27(5):782-786.

[12] Atapattu L, Saha N, Chheang C, et al. An activated form of ADAM10 is tumor selective and regulates cancer stem-like cells and tumor growth. J Exp Med, 2016, 213(9):1741-1757.

[13] Zhang W, Liu S, Liu K, et al. Knockout of ADAM10 enhances sorafenib antitumor activity of hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo. Oncol Rep, 2014, 32(5):1913-1922.

[14] Fu L, Liu N, Han Y, et al. ADAM10 regulates proliferation, invasion, and chemoresistance of bladder cancer cells. Tumor Biol, 2014, 35(9):9263-9268.

[15] O'Neill KL, Kai H, Zhang J, et al. Inactivation of prosurvival Bcl-2 proteins activates Bax/Bak through the outer mitochondrial membrane. Genes Dev, 2016, 30(8):973-988.

[16] Guo J, Du J, Fei D, et al. miR-152 inhibits rheumatoid arthritis synovial fibroblast proliferation and induces apoptosis by targeting ADAM10. Int J Mol Med, 2018, 42(1):643-650.

[17] Schattner A. ACP Journal Club. Review: In rheumatoid arthritis, TNF-α inhibitors do not differ from placebo or DMARDs for all-cause mortality. Ann Intern Med, 2016, 164(4):JC20.

[18] Gualtierotti R, Ingegnoli F, Griffini S, et al. Prothrombotic biomarkers in patients with rheumatoid arthritis: the beneficial effect of IL-6 receptor blockade. Clin Exp Rheumatol, 2016, 34(3):451-458.

[19] Li YJ, Fan YH, Tang J, et al. Meprin-β regulates production of pro-inflammatory factors via a disintegrin and metalloproteinase-10 (ADAM-10) dependent pathway in macrophages. Int Immunopharmacol, 2014, 18(1):77-84.

Effect of ADAM10 gene silencing on apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis

WANG Pei, CHU Tian-shu, YAN Lei, LIU Bing, ZHU Qing, SHAO Feng-min

Department of Immunology and Rheumatology (WANG Pei, CHU Tian-shu), Department of Nephropathy (YAN Lei, LIU Bing, ZHU Qing, SHAO Feng-min), Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450003, China

To investigate the effect of ADAM10 gene silencing on apoptosis of synovial fibroblasts in rheumatoid arthritis.

ADAM10-specific siRNA was transfected into human rheumatoid arthritis synovial fibroblast MH7A cells. The experiment was divided into 3 groups: ADAM10-siRNA group, NC-siRNA group and control group, which were transfected with ADAM10-specific siRNA, ADAM10 non-specific siRNA or nothing, respectively. After 48 h of transfection, qRT-PCR and Western blot were used to detect the expression of ADAM10 in each group. Flow cytometry was used to detect apoptosis. The expression levels of apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax were detected by qRT-PCR. The levels of TNF-α, IL-6 and IL-8 in the cell culture supernatant were determined by ELISA.

The expression of ADAM10 mRNA and protein in the ADAM10-siRNA group was significantly lower than that in NC-siRNA group and control group (< 0.05). After silencing the ADAM10 gene, the apoptosis rate of the ADAM10-siRNA group was significantly higher than that of the NC-siRNA group and the control group (< 0.05). The expression of Bax gene in ADAM10-siRNA group was significantly higher than that in NC-siRNA group and control group (< 0.05). The expression level of Bcl-2 gene was significantly lower than that in NC-siRNA group and control group (< 0.05). TNF-α, IL-6 and IL-8 secreted by ADAM10-siRNA group were significantly lower than those of NC-siRNA group and control group (< 0.05). Compared with the above indexes in the NC-siRNA group and the control group, the difference was not significant (> 0.05).

ADAM10 gene silencing can significantly promote the apoptosis of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and further reduce inflammatory factors such as TNF-α, IL-6 and IL-8, suggesting that silencing of ADAM10 gene makes it possible to reduce/control rheumatoid arthritis inflammation.

Arthritis, rheumatoid; Rheumatoid arthritis synovial fibroblasts; ADAM10 gene; Apoptosis

SHAO Feng-min, Email: 250478232@qq.com

2017 年河南省醫學科技攻關計劃項目（201702180）

邵鳳民，Email：250478232@qq.com

2018-12-17

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.006