胞外囊泡對(duì)血管生成影響的研究進(jìn)展

劉月榮，陳曦，田野

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胞外囊泡對(duì)血管生成影響的研究進(jìn)展

劉月榮，陳曦，田野

150001 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科

胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是由不同細(xì)胞產(chǎn)生并釋放到細(xì)胞外的囊泡。最初被認(rèn)為是無生物學(xué)功能的細(xì)胞碎片，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)其在血管生成、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用。EVs 攜帶了許多表面受體、遺傳物質(zhì)、生物活性分子等，在細(xì)胞間傳遞信息，從而在血管生成過程中發(fā)揮了重要作用。本文就 EVs 對(duì)血管生成影響的研究進(jìn)展綜述如下。

1 胞外囊泡的產(chǎn)生和生物學(xué)特性

EVs 是指在正常和應(yīng)激狀態(tài)下由不同細(xì)胞產(chǎn)生的脂質(zhì)雙分子層包繞的球囊狀結(jié)構(gòu)[1]。根據(jù)其大小和生成途徑，EVs 可分為 3 種主要類型：外泌體、微泡和凋亡小體。外泌體的直徑在 30 ~ 120 nm 之間，微泡直徑在 100 ~ 1000 nm 之間，凋亡小體直徑在 800 ~ 5000 nm 之間。外泌體是由細(xì)胞膜與胞體內(nèi)陷形成的多泡體融合釋放而成，微泡則直接由細(xì)胞膜出芽生成，凋亡小體是由 caspase 介導(dǎo)的程序性死亡細(xì)胞出泡形成的[2]。研究發(fā)現(xiàn)，某些特異蛋白在 EVs 的生成和釋放中發(fā)揮重要的作用，如四跨膜蛋白家族分子（CD81、CD9 和 CD63）、熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP90）、轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物（Tsg101、Alix）、參與膜融合的蛋白質(zhì)（Rabs、ARF6）和信號(hào)蛋白等[3-4]。此外，這些過去被認(rèn)為是外泌體特異性的蛋白也可以在微泡中被檢測(cè)出。所有 EVs 亞群體中的蛋白質(zhì)分布不均勻[5-6]。不同的細(xì)胞產(chǎn)生的 EVs 往往帶有其細(xì)胞膜上的特異性受體。而 EVs 膜脂質(zhì)組成及分布與母細(xì)胞不相同[3]。EVs 的質(zhì)膜富含磷脂酰絲氨酸、糖鞘脂、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺和膽固醇。而在 EVs 上表達(dá)的磷脂酰絲氨酸是其特征之一。除表面分子外，EVs 中還含有可溶性因子，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子[3]。除了蛋白質(zhì)和脂類，EVs 還可以整合遺傳物質(zhì)，例如小而長(zhǎng)的編碼和非編碼的 RNA（mRNA、miRNA 和 IncRNA），以及其他細(xì)胞質(zhì)成分和分子。

2 EVs 與血管生成

血管生成是指在已經(jīng)存在的血管網(wǎng)絡(luò)中形成新的血管的過程，存在于有機(jī)體的生長(zhǎng)和發(fā)育中。血管生成有以下兩種方式：一種是出芽式血管生成，經(jīng)過血管基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）的增殖、遷移、發(fā)芽、分枝，形成新血管；另一種是套疊式血管生成，通過間質(zhì)組織侵入現(xiàn)有血管，形成跨血管組織柱，隨后血管擴(kuò)張和分裂形成新血管。新血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和成熟需要周細(xì)胞的聚集、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和剪切應(yīng)力的機(jī)械刺激[2]。在健康的組織中，血管生成被促血管生成信號(hào)和抗血管生成信號(hào)精確平衡地調(diào)控。當(dāng)這種平衡受到干擾時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)血管生成異常，這是許多疾病進(jìn)展的主要原因，如癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、角膜新生血管、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和缺血性疾病等。因此，EVs 在血管形成過程中發(fā)揮重要的作用（表 1）。

2.1 EVs 促血管生成的作用機(jī)制

EVs 可通過向 ECs 傳遞促血管生成的 miRNA 發(fā)揮促血管生成作用。ECs 源性的外泌體中的 miR-214通過抑制其他內(nèi)皮細(xì)胞 ATM 的表達(dá)，在體外和體內(nèi)發(fā)揮促血管生成作用[7]。經(jīng)過 IL-3 刺激的 EC 產(chǎn)生的 EVs 通過將 miR-126-3p 轉(zhuǎn)移到受體 EC，導(dǎo)致 Spred-1 降低，ERK1/2 激活，從而促進(jìn)血管生成[8]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡小體中的 miR-126 可以通過誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠靶細(xì)胞中 CXCL 12 的表達(dá)和內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPC）的募集發(fā)揮促血管生成的作用，并增加斑塊穩(wěn)定性而產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[9]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮克隆形成細(xì)胞（endothelial colony-forming cells，ECFC）的EVs 還可以預(yù)防大鼠腎缺血再灌注損傷后毛細(xì)血管稀疏和組織損傷。去除 EVs 中的 miR-126 和 miR-296 腎臟保護(hù)作用消失，說明 miR-126 和 miR-296 血管生成中起關(guān)鍵作用[10]。脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）通過外泌體將 miR-125a 轉(zhuǎn)運(yùn)至 EC，抑制 DLL4 表達(dá)，增加頂細(xì)胞的形成，在體內(nèi)外發(fā)揮促血管生成的作用[11]。此外，用內(nèi)皮分化培養(yǎng)基對(duì)脂肪源性 MSCs 預(yù)處理可使微泡生成增加，這些微泡通過傳遞 miR-31 和抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α 的抑制因子表達(dá)，增強(qiáng)促血管生成的作用[12]。小鼠骨髓來源的 MSC 經(jīng)過腦缺血組織提取物處理后產(chǎn)生的 EVs 富含 miR-210，miR-210 被轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)皮細(xì)胞中抑制 EFNA3 基因的表達(dá)，促進(jìn)血管生成[13]。同時(shí)，人臍帶源性 MSC 產(chǎn)生的外泌體通過激活 Wnt 4/β-catenin 通路發(fā)揮促血管生成作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞源性的微泡可以通過將 miR-150 轉(zhuǎn)運(yùn)到 EC 發(fā)揮促血管生成的作用[15]。

表 1 EVs 調(diào)控血管生成的主要機(jī)制

EVs 可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)某些蛋白質(zhì)發(fā)揮促血管生成的作用。通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)條件，可以大大提高 EVs 的血管生成潛能。研究發(fā)現(xiàn)用血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）處理脂肪源性 MSCs 產(chǎn)生的 EVs 中c-kit、干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）和基質(zhì)金屬蛋白酶含量的增加，從而增強(qiáng)其促血管生成作用。低氧處理臍帶源性 MSCs 產(chǎn)生的 EVs 富含 VEGF，從而增加促血管生成的作用。單側(cè)腎缺血大鼠經(jīng)靜脈注射這種 EVs，增加了缺血腎臟的毛細(xì)血管密度，從而發(fā)揮保護(hù)腎功能的作用[16]。血小板產(chǎn)生的微泡能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖、管狀結(jié)構(gòu)的形成，同時(shí)增強(qiáng)損傷后內(nèi)皮再生的能力。研究發(fā)現(xiàn)，用從動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血中分離的血小板源性微泡處理循環(huán)血管生成細(xì)胞，可使大鼠缺血的后肢新生血管增多[17]。這種促血管生成作用與血小板源性微泡釋放的受激活調(diào)節(jié)正常 T 細(xì)胞表達(dá)和分泌因子有關(guān)。在主動(dòng)脈環(huán)模型鼠中，血小板源性微泡通過傳遞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）和 PDGF 以及激活 PI3 激酶、src 激酶和 ERK 通路，以劑量依賴性的方式發(fā)揮促血管生成作用[18]。同時(shí)，在慢性心肌缺血的大鼠模型中，靜脈注射血小板微泡可增加心肌功能和毛細(xì)血管的數(shù)量，保護(hù)心功能。此外，C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）具有促血管生成的作用。2012 年澳大利亞學(xué)者在急性心肌梗死的患者血液標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)微泡可以轉(zhuǎn)運(yùn)單體 CRP 至ECs 并活化 ECs[19]。近期研究發(fā)現(xiàn)，攜帶音猬因子（sonic hedgehog，SHH）的微泡通過抑制 NO 的產(chǎn)生和減少氧化應(yīng)激，改善了血管緊張素 II 誘導(dǎo)的高血壓和主動(dòng)脈內(nèi)皮功能[20]。

EVs 也可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)一些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮促血管生成的作用，如 pSTAT 3 和 pSTAT 5。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血狀態(tài)下，骨髓源性 MSCs 的外泌體通過轉(zhuǎn)運(yùn) pSTAT 3 及激活 NF-κB 通路發(fā)揮促血管生成的作用[21-22]。而 IL-3 處理的ECs 產(chǎn)生的 EVs 通過將 pSTAT 5轉(zhuǎn)運(yùn)到 EC，增加 cyclinD1 翻譯，從而促血管生成[8]。

2.2 EVs 抗血管生成的作用機(jī)制

EVs 的抗血管生成作用在視網(wǎng)膜病變和腫瘤血管生成等病理性血管生成方面具有重要的治療作用。EVs 誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，通過內(nèi)皮細(xì)胞的 CD36 和 EVs 磷脂酰絲氨酸結(jié)合，激活 Fyn 激酶和 NADPH 氧化酶，產(chǎn)生活性氧，抑制 ECs 遷移和管腔形成[23]。研究發(fā)現(xiàn)，T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的微泡對(duì)血管生成的抑制作用是由低密度脂蛋白受體介導(dǎo)的，將靶 ECs 和腫瘤細(xì)胞中的低密度脂蛋白受體敲除，導(dǎo)致微泡攝取減少，導(dǎo)致 T 淋巴細(xì)胞微泡抗血管生成作用消失[24]。

3 EVs 治療血管生成的前景

在各種研究的基礎(chǔ)上，EVs 已經(jīng)成為細(xì)胞間通訊的主要形式，在血管生成中起著重要的作用。EVs 廣泛參與了血管生成、生長(zhǎng)和成熟。自 21 世紀(jì)初以來，EVs 已在黑色素瘤[25]、非小細(xì)胞肺癌[26-27]、結(jié)直腸癌[28]、I 型糖尿病（Nct 02138331）患者中進(jìn)行了臨床試驗(yàn)。雖然參與研究的患者數(shù)量不多，但這些臨床試驗(yàn)證明了 EVs 在人體內(nèi)應(yīng)用的可行性和安全性。最近，一項(xiàng)前瞻性的臨床試驗(yàn)被啟動(dòng)，評(píng)價(jià)自體血漿來源的外泌體對(duì)頑固性皮膚潰瘍（Nct 02565264）患者傷口愈合的影響。這項(xiàng)臨床試驗(yàn)將提供關(guān)于 EVs 干預(yù)血管生成的可行性和有效性的重要信息。

4 問題與展望

EVs 領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速，現(xiàn)在已經(jīng)成為了研究熱點(diǎn)，尤其在癌癥、卒中等疾病中研究廣泛。EVs 不僅可以通過自身發(fā)揮作用，還可以通過運(yùn)輸藥物發(fā)揮作用，甚至用于一些基因治療。由此可見 EVs 是極具前景的領(lǐng)域。越來越多的研究證實(shí)了 EVs 通過調(diào)節(jié) ECs 參與血管生成。與其他調(diào)節(jié)腫瘤、腦卒中、動(dòng)脈粥樣硬化、損傷后修復(fù)等疾病中的血管生成的方法相比，EVs 治療具有靶向性、無免疫原性、無致瘤性、安全性、儲(chǔ)存和運(yùn)輸方便等優(yōu)點(diǎn)。EVs 將有希望成為干預(yù)血管生成的新手段，但 EVs 研究仍面臨著許多挑戰(zhàn)。其中關(guān)于 EVs 的應(yīng)用濃度仍然存在很大爭(zhēng)議。研究發(fā)現(xiàn)，EVs 對(duì)血管生成的影響是與劑量相關(guān)的。而現(xiàn)有研究 EVs 的量化方法不同，所以 EVs 發(fā)揮調(diào)節(jié)血管生成而又無副作用的濃度無法確定。不同的分離和提純 EVs 的方法也影響其完整性及功能。此外，EVs 的細(xì)胞來源和給藥途徑是其組織分布的關(guān)鍵決定因素。因此，在正常和病理?xiàng)l件下建立 EVs 的最佳給藥途徑、產(chǎn)生條件、統(tǒng)一分離提純及量化方法有助于提高其治療效果。

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國(guó)家自然科學(xué)基金（81371709）

田野，Email：yetian6@163.com

2018-12-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.011