吸煙者外周血不同T淋巴細胞亞群在體外擴增中的異常增殖及功能研究

葛汝村，李培培，李安娜，徐林，戴曉宇，王換換，李棟

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吸煙者外周血不同T淋巴細胞亞群在體外擴增中的異常增殖及功能研究

葛汝村，李培培，李安娜，徐林，戴曉宇，王換換，李棟

250031 濟南，山東省立第三醫院再生醫學研究室（葛汝村、李培培、徐林）；250012 濟南，山東大學齊魯醫院低溫醫學研究室（李安娜、戴曉宇、王換換、李棟）

檢測吸煙對外周血 T 淋巴細胞體外擴增培養過程中免疫殺傷細胞和調節性 T 細胞增殖和功能的不同影響。

選擇平均年齡 30 歲的男性吸煙者 27 例與不吸煙男性健康對照組 16 例，采用密度梯度離心法從外周血中分離淋巴細胞，添加抗 CD3 和抗 CD28 抗體，以及 IL-2 和 IFN-γ 等多種細胞因子擴增培養 15 d，計算細胞的增殖率，并利用流式細胞術檢測擴增后各組淋巴細胞中免疫殺傷細胞（CD3+CD8+細胞、CD3+CD56+細胞）以及調節性 T 細胞（CD4+CD25+細胞）的比率；CCK8 法檢測擴增后的免疫殺傷細胞對 HeLa 細胞的殺傷力，PCR 方法檢測擴增后淋巴細胞部分功能相關基因的表達。

吸煙者外周血淋巴細胞增殖能力減弱，且免疫殺傷細胞所占比例低，調節性 T 細胞所占比例高；吸煙者細胞免疫殺瘤細胞的殺傷力明顯低于不吸煙對照組，吸煙組淋巴細胞表達的 TNF-α、顆粒酶、穿孔素和 IFN-γ 等均有不同程度降低，其中顆粒酶和顆粒溶解素下調較為明顯；但吸煙組 TGF-β1 的表達量顯著上調，約為對照組的 7 倍。

吸煙導致擴增后的外周血淋巴細胞中免疫殺傷細胞所占比例減少，調節性 T 細胞比例增加，吸煙組 TGF-β1 的表達增加進一步抑制了免疫殺傷細胞的活化和增殖。

吸煙； T 淋巴細胞，調節性； 轉化生長因子-β； 免疫殺傷細胞

眾所周知吸煙有害健康，中國每年大約12% 的男性死于煙草的使用。煙草含有包括尼古丁在內的 1200 多種有害物質，其中 10 多種為致癌物質，這些有害物質能明顯降低人體的免疫功能，降低人體的免疫反應能力[1]，使人易患肺癌、膀胱癌、心臟病等諸多疾病[2-4]。殺傷性 T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）與調節性 T 細胞（regulatory T cells，Treg）在機體免疫系統功能中發揮重要作用[5-6]，本研究擬通過比較吸煙者與不吸煙者外周血 T 淋巴細胞在體外擴增中的增殖力、殺瘤力和相關基因的表達，探討吸煙降低機體免疫功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 RPMI 1640 培養基購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國 Gibco公司；羊抗人 CD3 抗體和羊抗人 CD28 抗體購自北京同立海源生物科技有限公司；白介素 IL-2、IL-15、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和 PE 熒光單克隆抗體試劑 IgG1、CD3、CD25、FITC 熒光單克隆抗體試劑IgG1、IgG2b、CD4、CD8、CD56 均購自美國 R&D 公司；人外周血淋巴細胞分離液（密度 1.077）購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；RealMasterMix SYRB Green PCR 試劑盒和 Cell counting kit8 試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；450 型酶標儀為 BD公司產品；Guava easy Cyte8HT 流式細胞儀購自美國 EMD Millipore 公司；7500 熒光定量 PCR 儀為美國ABI 公司產品。

1.1.2 實驗對象 吸煙組：年齡24 ~ 39（平均年齡 30 歲）的男性（n = 27），經臨床全面體檢，肝功能檢查正常，甲胎蛋白（AFP）及乙肝病毒表面抗原（HBsAg）陰性，血糖正常，排除患有疾病者。吸煙標準：平均每天吸煙大于等于 10 支，列為吸煙組。對照組：生活在同一地區，平均年齡 30 歲（n = 16），從未吸煙的男性，經臨床全面體檢，肝功能檢查正常，AFP 及 HBsAg 陰性，血糖正常，排除患有疾病者。

1.2 方法

1.2.1 人外周血 T 淋巴細胞亞群的體外擴增 經供者授權同意后，在一周內完成吸煙組和對照組的隨機靜脈采血。在無菌條件下，用肝素鈉抗凝的真空采血管采集供者外周靜脈血 20 ml，常規梯度密度離心法（密度 = 1.077 g/L）獲得單個核淋巴細胞，使用含 10% FBS 的 RPMI 1640 培養基作為淋巴細胞擴增基礎培養基，按終濃度加入 PHA（2 μg/ml）、IFN-γ（50 ng/ml），細胞起始培養密度為5 × 106個/ml。置于 37 ℃、5% CO2、100% 飽和濕度的細胞培養箱內培養。次日加入抗 CD3（50 ng/ml）、抗 CD28（50 ng/ml）、IL-2（1000 U/ml）和 IL-15（10 ng/ml）。以后每 2 ~ 3 天添加培養液并按終濃度加入 IL-2（1000 U/ml)）和 IL-15（10 ng/ml）。每 3 天抽取少量細胞計數。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞表型 取預檢測細胞，用 PBS 液 1000 r/min 離心 5 min 洗滌細胞 2 次，棄上清。細胞沉淀加入 120 μl 鞘液充分吹懸并用 70 μm 濾網過濾，分別加入 PE 或 FITC 標記的單克隆抗體以及相應的同型對照抗體 5 μl，充分渦旋振蕩混勻，避光孵育 15 min 后，加入 1000 μl 流式鞘液充分混勻后 1000 r/min 離心5 min 并離心洗滌 1 次，進行流式細胞檢測，流式分析軟件 Guava Incyte 分析所得數據。

1.2.3 CCK8 法檢測擴增后 T 淋巴細胞對HeLa 細胞的殺傷率 HeLa 細胞培養于含 10% FBS 的 RPMI 1640 培養基中，消化后以每孔 1 × 105個/100 μl種于 96 孔板中，培養 12 h 后，每孔加入100 μl 擴增后的 T 淋巴細胞懸液（含 10% FBS 的RPMI 1640 培養基中細胞 1 × 106個），效靶比為 10:1，在培養箱孵育 6 h，然后向每孔加入 10 μl CCK8 溶液，培養箱內繼續孵育 1 h，酶標儀測定 450 nm 處的吸光度。計算公式如下：

細胞殺傷率 =[1 –（效靶細胞值– 效應細胞值）/靶細胞值]× 100%

1.2.4 Real-time PCR 檢測基因表達 取上述各組擴增前后單個核細胞各 1 × 106個，以新鮮分離的健康人外周血 MNC 細胞作為對照組，提取 RNA，并反轉錄為 cDNA，以反轉錄產物為模板進行 PCR，各基因檢測用引物序列見表 1，操作步驟如下進行，反應體系為20 μl：10 μl 2 × Ultra SYBR Mixture，前后引物（10 μmol/L）各 1 μl，模板 1 μl。反應程序為：95 ℃預變性 10 min；隨后進行 40 個循環 95 ℃變性 15 s；60 ℃退火/延伸 1 min 讀板。每個樣本 3 次重復，以 GAPDH 為內參基因，先按照公式ΔΔCT = ΔCT待測– ΔCT對照對各試驗樣本的ΔCT值進行歸一，再用2?ΔΔCT計算各組的相對表達量，并將新鮮對照組的表達值設為 1。

1.3 統計學處理

表 1 定量 PCR 中所用引物序列

2 結果

2.1 淋巴細胞增殖檢測

淋巴細胞增殖是機體免疫應答過程的一個重要階段。因此，檢測淋巴細胞增殖水平是細胞免疫研究和臨床免疫功能檢測的一種常用方法。為了探究吸煙是否能夠影響機體的免疫力，首先分離淋巴細胞，然后經 IFN-γ、抗 CD3 抗體和 IL-2 等激活擴增 T 淋巴細胞培養后計數，可見前 3 天細胞生長緩慢，細胞密度低（圖 1A），但健康正常組T 細胞在第 3 天即進入快速增殖期，而吸煙組的 T 細胞第 6 天才進入快速增殖期。快速增殖的淋巴細胞密度顯著增加，并形成克隆球（圖 1B）。經過 21 d 的培養，對照組（不吸煙）細胞總數增殖倍數平均約為 36 倍，而吸煙組細胞僅擴增25.7 倍左右，明顯低于對照組（< 0.01），如圖 1C 所示。

2.2 吸煙組淋巴細胞擴增后免疫殺傷細胞比例減少，調節性 T 細胞比例增加

擴增方案不但可以擴增殺傷性 T 淋巴細胞[6]，也可以擴增調節性 T 淋巴細胞[7]，流式細胞術結果顯示擴增后吸煙組免疫 T 淋巴殺傷細胞（CD3+CD56+和 CD3+CD8+細胞）所占比例低于對照組，而調節性 T 淋巴細胞（CD4+CD25+）所占比例為（8.99 ± 0.85）%，顯著高于對照組的（1.70 ± 0.32）%（= 40.12，< 0.01），如圖 2A 所示。

2.3 吸煙者淋巴細胞殺瘤能力低于對照組

將吸煙組與對照組擴增后的 T 淋巴細胞與 HeLa 細胞共培養，檢測其對腫瘤細胞的殺傷力，結果顯示對照組淋巴細胞殺傷率為（77.01 ± 1.19）%，吸煙組淋巴細胞殺傷率平均僅為（56.37 ± 7.90）%，兩者具有極顯著差異（= 13.32，< 0.001），如圖 2B 所示。

2.4 吸煙可以降低殺傷相關基因表達，促進 TGF-β1 的表達

為了進一步研究吸煙對 T 淋巴細胞的影響，利用 Real-time PCR 技術檢測了兩組擴增后的淋巴細胞中，部分免疫殺傷相關基因以及 TGF-β1 的 mRNA 表達量，結果顯示與對照組相比，吸煙組淋巴細胞表達的 TNF-α、顆粒酶A 和 B、顆粒溶解素、穿孔素和 IFN-γ 等均有不同程度降低，其中顆粒酶和顆粒溶解素下調較為明顯（< 0.01）；但吸煙組 TGF-β1 的表達量顯著上調，約為對照組的 7 倍（= 89.35，< 0.001），如圖 2C 所示。

3 討論

煙草中主要成分尼古丁能迅速溶于水及酒精中，通過口鼻支氣管黏膜很容易被機體吸收，對人體產生多種危害。例如尼古丁可抑制人牙周膜成纖維細胞的生長，使處于增殖狀態的牙周膜成纖維細胞阻滯于 G2/M，使牙周膜喪失自我修復的能力[8]。在本研究中，結果顯示吸煙可以抑制外周血中免疫殺傷細胞（CD3+CD8+、CD3+CD56+）的增殖，上調擴增產物中調節性 T 細胞（CD4+CD25+）的比例。

尼古丁對淋巴細胞的影響主要是通過 CD4+細胞表達的煙堿樣乙酰膽堿受體發揮作用的，從而對 T 淋巴細胞活化、增殖和分泌細胞因子產生影響[9-11]，同樣尼古丁也可以通過PI3-K/Akt 途徑上調環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，Cox-2）和前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）的產量[12]。尼古丁結合煙堿樣乙酰膽堿受體還可以引起 cAMP 和 Ca2+動員[13]，從而全面影響免疫細胞功能，例如尼古丁可以降低牙齦組織中的免疫細胞數目、趨化性和吞噬能力，從而降低牙齦組織的免疫防御力[14]。如果在妊娠期吸煙[尼古丁量 6 mg/(kg·d)]就會長期抑制免疫細胞的增殖[15]。PCR 的結果還顯示吸煙組淋巴細胞表達的 TNF-α、顆粒酶 A 和 B、穿孔素和 IFN-γ 等相關細胞因子的表達水平均降低，其中顆粒酶和顆粒溶解素下調較為明顯。免疫殺傷細胞的殺傷率是考量機體免疫力的一個重要參數。我們檢測吸煙組與對照組淋巴細胞對 HeLa 細胞的殺傷力，結果顯示吸煙組對 HeLa 細胞的殺傷力明顯低于對照組，這與穿孔素和 IFN-γ 等多種基因的表達下調直接相關。

圖 1 細胞增殖能力檢測（A：擴增前的淋巴細胞；B：進入快速擴增期的淋巴細胞；C：到第 21 天對照組細胞增殖倍數約為 36 倍，吸煙組細胞增殖約 25.7 倍，在擴增細胞總數上比正常組有顯著降低，*P < 0.01）

Figure 1 Cell proliferation assay (A: Lymphocytes before amplification; B: Lymphocytes in the rapid expansion phase; C: The lymphocytes in control group proliferated about 36 times after 21 days culture, while the smoking group only amplified about 25.7 times,*< 0.01)

圖 2 擴增后淋巴細胞的免疫表型、殺瘤能力及基因表達分析[A：擴增后吸煙組免疫 T 淋巴殺傷細胞（CD3+CD56+和 CD3+CD8+細胞）所占比例低于對照組，而調節性 T 淋巴細胞（CD4+CD25+）顯著高于對照組；B：淋巴細胞對 HeLa 細胞殺傷結果顯示吸煙組的淋巴細胞殺傷率比對照組低約20%；C：定量 PCR 檢測擴增后 T 細胞內部分基因的表達，以新鮮分離的健康人外周血 MNC 細胞作為對照組，并將其表達值設為 1；*P < 0.01 vs.對照組；**P < 0.001 vs.對照組]

Figure 2 Immune phenotype, tumor killing ability and gene expression analysis after lymphocytes amplification [A: Cytotoxicity T lymphocyte (CD3+CD56+and CD3+CD8+cells) is lower in smoking group than the control group, but regulatory T cells (CD4+CD25+) regulatory T cells was significantly higher than the control group; B: Tumor killing ability of smoking group is lower than the control group about 20%；C: The expression of some important genes in expanded T cells, compared with fresh isolated MNC as control (set the value as 1);*< 0.01control group;**< 0.001control group]

但研究發現，尼古丁并不殺死免疫細胞，相反的，尼古丁可以抑制地塞米松誘導的免疫細胞凋亡[16]，實驗結果發現吸煙者在相同的 T 淋巴細胞增殖刺激下，產生的 Treg 細胞比例增高。研究顯示 TGF-β 可以誘導 CD4+CD25-細胞轉變為 CD4+CD25+Treg 細胞[17]。于是采用定量 PCR 的方式檢測了 TGF-β 在核酸水平的表達量變化，結果顯示吸煙組的 PBMC 培養擴增 15 d 后，吸煙組 TGF-β1 的表達量顯著上調，約為對照組的7 倍，所以我們猜測吸煙引發吸煙者淋巴細胞中調節性 T 細胞比例的增加是由于 TGF-β 的過量表達所致。

綜上所述，吸煙降低機體免疫力的機制可能是由于吸煙導致免疫殺傷細胞數量減少而且功能下降；并且尼古丁可以促進淋巴細胞中 TGF-β 的表達，TGF-β 誘導調節性 T 細胞 Treg 的比例增加，進一步抑制了免疫殺傷細胞的活化和增殖，從而導致機體免疫力降低，下一步我們將在體內動物實驗中進一步驗證尼古丁對免疫力的影響。

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Abnormal proliferation and function of different T lymphocyte subsets in peripheral blood of smokers

GE Ru-cun, LI Pei-pei, LI An-na, XU Lin, DAI Xiao-yu, WANG Huan-huan, LI Dong

Regenerative Medicine Laboratory, Shandong Provincial Third Hospital, Ji'nan 250031, China (GE Ru-cun, LI Pei-pei, XU Lin); Cryomedicine Laboratory, Qilu Hospital of Shandong University, Ji'nan 250012, China (LI An-na, DAI Xiao-yu, WANG Huan-huan, LI Dong)

To investigate the different effects of cigarette smoking on proliferation and function of immune killer cells and regulatory T cells during the expansion of peripheral blood T lymphocytes.

Twenty-seven male smokers and sixteen healthy controls of non-smokers with an average age of 30 years were selected. Peripheral lymphocytes were isolated using density gradient centrifugation. Anti-CD3 and anti-CD28 antibody, IL-2, IFN-γ and other cytokines were used for lymphocyte amplification for 15 days. Cell proliferation, and the ratio of killer T cells (CD3+CD8+cells, CD3+CD56+cells) and regulatory T cells (CD4+CD25+cells) were analyzed by FACS. CCK8 method was used to detect the tumor killing activity on HeLa cells. The expression of some immune related genes were detected using PCR method.

The proliferation ability of peripheral lymphocyte were decreased in smokers, while the proportion of regulatory T cells were high in smokers. Tumor killing activity was significantly lower in smoking group than that in control group. The expression of TNF-α, granzyme, IFN-γ and perforin were also reduced in smokers. But the expression of TGF-β1 was up-regulated in smoking group.

Smoking reduced immune killer cells rate in peripheral lymphocyte amplification but increased the proportion of regulatory T cell proportion. Up-regulation of TGF-β1 in smoking group further inhibits immune cell activation and proliferation.

Smoking; T lymphocytes, regulatory; Transforming growth factor beta; Immune killer cells

LI Dong, Email: lidong73@sdu.edu.cn

李棟，Email：lidong73@sdu.edu.cn

2018-12-18

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.008