植物乳桿菌和蛋白酶協同發酵水解大米蛋白ACE抑制肽高活性組分的氨基酸序列分析

鄒俊哲，林凱，楊旭，譙飛，韓雪，劉紅彥，楊艷艷，劉漢民，張蘭威，5，*（.中國海洋大學基礎教學中心，山東青島6600；.哈爾濱工業大學化工與化學學院，黑龍江哈爾濱50090；.哈爾濱市食品工業研究所有限公司，黑龍江哈爾濱50090；.中恩（天津）營養科技有限公司，天津00000；5.華羚生物技術研究中心，甘肅蘭州70000）

高血壓是引起心腦血管疾病的元兇之一，它對人體的心腦血管和腎臟等器官具有較大損傷[1]。因此，研制能夠有效預防和治療高血壓的降壓藥物或保健食品已成為研究熱點[2]。其中食源性血管緊張素-I 轉換酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制肽因其溫和、高效以及無副作用而倍受青睞。ACE 又稱肽基-羧基肽酶，廣泛存在于人體各種器官中，其主要作用是將血管緊張素I（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu）C 端的兩個氨基酸（His-Leu）水解生成血管緊張素II（Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe）。血管緊張素II 是強有效的升壓物質，從而使血壓升高。同時，ACE 能夠導致使得血管舒張的舒緩激肽失活，從而進一步加劇血壓的升高[3]。研究表明，ACE 的底物轉移性較差，很多具有與血管緊張素I 結構類似的多肽都能夠與ACE 發生競爭性抑制，從而使ACE 活性降低，阻止血壓升高[4]。

許多蛋白質序列中含有與血管緊張素I 結構類似的多肽序列。目前，研究主要利用蛋白酶對各種蛋白進行水解，通過對獲得的水解物進一步分離純化，考察各組分的ACE抑制活性，從而獲得新型ACE抑制肽。有研究已經通過對油菜籽蛋白[5]、大豆蛋白[6]和蘑菇[7]等不同蛋白進行水解，分離純化獲得了多種具有ACE抑制活性的多肽片段。同時，也有研究利用乳酸菌水解植物蛋白制備具有ACE抑制活性水解物的研究[8]。蛋白酶及菌體發酵均能夠水解蛋白產生具有生物活性的物質，但很少有將蛋白酶與菌體發酵相結合用于制備功能性多肽的研究。蛋白酶與菌體結合可能會互補對方在水解方面的不足，從而制備獲得新型生物活性肽。

本研究通過植物乳桿菌2-18 與風味蛋白酶/菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶/酸性蛋白酶協同作用，制備腎病患者專用低蛋白大米，對獲得的富含多肽的大米蛋白脫除液進行多步分離純化，最終獲得具有高ACE抑制活性的多肽片段，并采用液質聯用（liquid chromatographmass spectrometer，LC-MS）測定其氨基酸序列，驗證其ACE抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用大米購于天津市寶坻區喜旺米加工有限公司；枯草芽孢桿菌Y（Bacillus subtilisY）、枯草芽孢桿菌Y4-2（Bacillus subtilisY4-2）由哈爾濱工業大學乳品科學實驗室提供；胃蛋白酶：美國Sigma 公司；菠蘿蛋白酶、風味蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶：諾維信（中國）生物技術有限公司；ACE（1 UN）：Sigma 公司；蛋白純化系統：美國GE 公司，液質聯用（Liquid Chromatography-Mass LC-MS）：美國Agilent 公司；3-30K 高速冷凍離心機：美國Sigma 公司，生物發酵罐：上海保興生物設備工程，Millipore8400 超濾杯：美國密理博公司。

1.2 菌酶組合發酵水解大米蛋白

將植物乳桿菌2-18 預先活化2 次，按總體系的5 %（體積分數）接種于大米水溶液中，于發酵罐中40 ℃30 r/min 條件下發酵9 h，使用200 目濾布過濾收集濾液。用等量蒸餾水清洗經乳桿菌處理后的大米，調整大米發酵液pH值至1.5，加入0.3%（E/S，質量分數）胃蛋白酶/酸性蛋白酶，控制溫度為40 ℃30 r/min條件下發酵18 h，過濾收集濾液，用等量蒸餾水清洗大米；調整大米發酵液pH值至6.8，溫度為45 ℃，加入0.3%（E/S，質量分數）風味蛋白酶/菠蘿蛋白酶，于45 ℃30 r/min 條件下發酵18 h，過濾收集過濾液，用蒸餾水清洗大米。將乳桿菌2-18 發酵液與兩次蛋白酶酶解液收集合并，經8 000 r/min 離心10 min，去除菌體和顆粒等雜質。將上清液通過3 kDa 的超濾膜，收集透過液。最后經冷凍干燥后，將樣品置于-20 ℃備用。采用凱氏定氮法測定大米蛋白脫除率[9]。

1.3 ACE抑制活性的測定

ACE抑制率測定步驟如下[10]：取25 μL 樣品，然后加125 μL 的馬尿酰組氨酸亮氨酸（N-hippuril-Lhistidy-L-leucine，HHL），在37 ℃水浴中預熱5 min，加入20 μL 的ACE（0.1 U/mL），37 ℃孵育1 h，然后加入350 μL 1 mol/L 的HCl 溶液以終止反應。向試管中加入1.7 mL 乙酸乙酯萃取生成的馬尿酸，旋渦震蕩15 s，在4 000 r/min 的條件下離心5 min，然后取上層液1 mL于120 ℃烘干，冷卻后加入1 mL 水溶解，超聲5 min，最后在228 nm 處測吸光值，以水作為空白對照。ACE抑制劑的活性通過下式計算：

其中A為空白組（即將25 μL 樣品換成緩沖液）吸光值，B為樣品組吸光值，C為ACE 失活組（即在加入ACE 之前先加入350 μL HCl，使ACE 失活）吸光值。采用BCA 測定試劑盒測定濾液中多肽含量。

1.4 大米蛋白發酵水解液中ACE抑制肽的分離純化

將經植物乳桿菌2-18+胃蛋白酶/酸性蛋白酶+風味蛋白酶/菠蘿蛋白酶處理后的大米蛋白發酵水解液經如下步驟進行分離純化。

1.4.1 陽離子交換色譜層析

首先，選用陽離子交換層析柱進行分離純化[11]。陽離子交換層析條件：離子交換柱選擇SP Sepherose Fast Flow（1.6 cm×20 cm），裝柱后經20%的乙醇、磷酸鹽緩沖溶液（含1 mol/L 的NaCl）沖洗，再用50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）平衡層析柱。上樣量為100 mL，用磷酸鹽緩沖溶液（含1 mol/L NaCl）進行梯度洗脫，洗脫流速為2 mL/min，每管收集5 mL，檢測波長280 nm。測定具有吸收峰管數的收集液的ACE抑制活性，將具有最高ACE抑制率的組分進行收集，經過冷凍干燥后進一步分離純化。

1.4.2 凝膠色譜層析

選擇分離分子量在100 Da～7000Da 之間的Superdex Peptide 10/300 GL 凝膠色譜柱進一步對上述組分進行分離純化[12]。柱條件：先用20%的乙醇沖洗柱子，再用30%的乙腈（含0.1%三氟乙酸）平衡柱子。上樣量為0.5 mL，洗脫液為30%的乙腈（含0.1%三氟乙酸），流速為0.5 mL/min，檢測波長280 nm，每管接收1 mL。測定具有吸收峰管數的收集液的ACE抑制活性，將具有最高ACE抑制率的組分收進行集，經過冷凍干燥后進一步分離純化。

1.4.3 高效液相色譜分離純化

將經凝膠層析得到的具有最高ACE抑制活性的組分用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography HPLC）進行分離純化[13]。色譜條件為：色譜柱使用Grom-sil 120 ODS-5 ST（5 μm，10.0 mm×250 mm），使用乙腈（含0.1%的三氟乙酸）進行梯度洗脫，洗脫條件為0%～50%的乙腈溶液（v/v，50 min），流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm。收集并測定具有吸收峰的組分的ACE抑制活性。

1.5 LC-MS鑒定ACE抑制肽序列

將HPLC 分離得到的具有最高ACE抑制活性的組分進行LC-MS 分析[14]。色譜條件：Express Peptide Es-C8 柱（100 mm×2.1 mm×2.7 μm），流動相A（0.3 %乙酸水溶液），流動相B（含0.3%乙酸的乙腈），梯度洗脫，3%～95%的B 30 min，95%～3%的B 5 min，流速0.3 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量15 μL。質譜條件：陽離子模式，質量范圍m/z：100～3 200，分離電壓200 V，噴嘴電壓50V，噴霧器壓力3.4×105Pa，毛細管電壓3500 V，氣體溫度350 ℃，氣體流速12 L/min，Skimmer 60 V[10]。

1.6 數據分析

采用SPSS 16.0 軟件對試驗數據進行統計學分析，各組數據間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中Duncan's 法進行分析，顯著性水平設定為P<0.05。

2 結果與討論

利用植物乳桿菌2-18+風味蛋白酶/菠蘿蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶分步進行大米蛋白發酵水解處理，測定蛋白脫除率為（91.32±1.6）%，對收集獲得的大米蛋白發酵水解液進行分離并考察相應組分的ACE抑制活性。

2.1 陽離子交換色譜處理效果

離子交換層析是用來分離純化多肽的常用方法，離子柱的固定相與帶相反電荷的多肽通過庫侖力結合吸附，再用與多肽帶有相同電荷的流動相洗脫，通過連續改變流動相的離子強度，從而將帶有不同強度電荷的多逐步洗脫，從而達到分離純化的目的[15]。首先，將大米蛋白發酵水解液進行SP Sepherose Fast Flow陽離子交換層析，其分離效果如圖1（a）所示。

通過吸收峰可知，樣品初步分為3 個組分，分別為AI、AII 和AIII。對這三管進行多肽含量和ACE抑制率的測定，圖1（b）是AI、AII 和AIII 這3 個組分的多肽含量和IC50值。其多肽含量分別為（1.22±0.048）、（1.87±0.034）、（1.98±0.053）mg/mL。IC50值分別為（0.267±0.014）、（0.355±0.013）、（0.442±0.015）mg/mL，組分AI 具有最高的ACE抑制活性。因此，將對AI 組分進行進一步分離純化。

2.2 凝膠色譜處理效果

將SP Sepherose Fast Flow 陽離交換色譜層析獲得的AI 組分收集并凍干成粉末，利用Superdex peptide 10/300 GL 凝膠色譜柱對該組分進一步進行分離純化。將凍干粉配制成2 g/L 的溶液進行分離純化。分離純化的結果如圖2（a）所示。由圖可知，通過使用凝膠色譜對AI 組分繼續進行分離，得到了BI、BII、BIII、BIV、BV、BVI 和BVII 共7 個組分。說明該試驗選用的Superdex peptide 10/300 GL 凝膠色譜柱能夠較好的分離小分子量多肽。試驗測定了不同組分的多肽含量和IC50值，如圖2（b）所示。

由結果可知，組分BIII、IV 和BV 的蛋白含量較高。同時測定不同組分的ACE抑制活性可知，BI、BII和BVII 均未測的具有ACE抑制活性。BIII、BIV、BV 和BVI 具有較強的ACE抑制活性，其IC50值分別為（111.20±3.10）、（87.58±2.20）、54.97、133.21 μg/mL。由此可知，BV 組分具有最高的ACE抑制活性。因此，收集BV 組分，將其凍干濃縮，進行下一步的反相高效液相色譜（reversed-phase high-performance liquid chromatography RE-HLPC）分離分析。

圖1 SP Sepherose Fast Flow陽離子交換色譜層析分離效果及各組分的多肽含量和ACE抑制抑制活性Fig.1 The results of cationic column chromatography separation and the peptide concentrations of different components and their ACE inhibitory activities

圖2 Superdex peptide 10/300 GL柱層析分離效果及不同組分的肽含量和ACE抑制IC50值Fig.2 The results of Superdex peptide 10/300 GL separation and the peptide concentrations of different components and their ACE inhibitory activities

2.3 高效液相色譜

將經冷凍干燥后的BV 組分配成的2 g/L 的多肽液，使用HPLC 對該組分進一步進行分離純化，見圖3。

結果如圖3（a）所示，在16.0 min～17.5 min 和17.5 min～18.0 min 獲得了兩個分離較好的吸收峰，分別為CI 和CII 組分。收集CI 和CII 分離液并冷凍干燥后測定兩組分的多肽濃度和ACE抑制活性，結果如圖3（b）所示。由結果可知CI 的IC50值為（33.81±2.10）μg/mL，低于于CII 組分的IC50值（61.31±3.20 μg/mL）。由結果可知，CI 組分具有較強的ACE抑制活性。試驗將進一步利用LC-MS 測定CI 組分的多肽序列。

圖3 RE-HPLC 分離效果及不同組分的肽含量和ACE抑制IC50值Fig.3 The result of RE-HPLC separation（a）and the peptide concentrations of different components and their ACE inhibitory activities（b）

2.4 LC-MS鑒定多肽序列分析結果

LC/MS 是用來分析多肽氨基酸序列信息的常用手段，本試驗將通過LC-MS 研究CI 組分的氨基酸序列，見圖4。

圖4 LC-MS 分析色譜圖及其對應的質譜圖Fig.4 The chromatogram of LC-MS analysis and the peaks in chromatogram corresponding of the spectrum.

圖4（a）是CI 組分液相色譜圖，圖譜具有一個單峰，說明CI 組分為單一物質。對應該液相色譜峰的質譜圖如圖4（b）所示，通過對質譜峰的分析，該物質的相對分子質量為838.445 6 Da。根據已知多肽的分子質量和多肽來源，用于推測多肽段序列結構已得到了廣泛的應用[16-17]。大米蛋白主要為谷蛋白，其序列可通過UniProt 網站獲得，其氨基酸序列為：

MASKVVFFAAALMAAMVAISGAQLSESEMRFRDRQCQREVQDSPLDACRQVLDRQLTGRERFQPMFRRPGALGLRMQCCQQLQDVSRECRCAAIRRMVRSYEESMPMPLEQGWSSSSSEYYGGEGSSSEQGYYGEGSSEEGYYGEQQQQPGMTRVRLTRARQYAAQLPSMCRVEPQQCSIFAAGQY。通過搜索該序列相對分子質量為（838.4±2）Da的肽序列。經過氨基酸序列比較，該多肽序列為：Val-Val-Phe-Phe-Ala-Ala-Ala-Leu。由結果可以發現，該序列中的氨基酸全部為疏水性氨基酸，已有研究表明，多肽序列中含有疏水性氨基酸能夠有利于其與ACE分子催化活性中心結合，從而發揮ACE抑制作用[18]。

3 結論

試驗采用了植物乳酸菌2-18 協同蛋白酶（風味蛋白酶/菠蘿蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶）分步脫除大米蛋白，大米蛋白脫除率可達（91.32±1.26）%。對蛋白脫除液進行陽離子交換層析、凝膠過濾層析和REHPLC 三步分離純化，獲得了具有較高ACE抑制活性的多肽組分，并對該多肽序列進行了LC-MS 分析，通過與大米的谷蛋白序列進行對比，確定了該ACE抑制肽序列為VVFFAAAL，其ACE抑制活性IC50值為33.81 μg/mL。本研究表明，經菌酶組合獲得的大米蛋白發酵水解能夠作為產ACE抑制肽的良好原料。