具有抗氧化活性的人源乳桿菌菌株篩選

李穎，劉玉珍，張雨晴，李新玲，牟光慶，妥彥峰，*

（1.大連工業大學食品學院，遼寧大連116034；2.新疆天潤乳業股份有限公司，新疆烏魯木齊830000）

1956年Harman 提出了自由基致衰理論，此后的大量研究證明自由基損傷可促使生命系統發生衰退性變化。自由基作用于機體內的蛋白質、核酸等生物大分子，造成氧化損傷，使細胞中毒凋亡，與衰老疾病密切相關。大部分的抗氧化劑來自于化學合成或天然物質的提取物。隨著科學的進步，越來越多的人認識到化學合成抗氧化劑的危害，而天然物質的提取又因為分離鑒定、復配、改性等問題的限制，阻礙了其發展。微生物資源豐富，生產周期短，原料低廉。微生物發酵法在將來很可能成為大規模獲得食用抗氧化劑的一條有效途徑[1]。

乳酸菌的抗氧化活性已得到了體內及體外實驗的證實[2-3]，早在1900年人們就已發現常食含有乳酸菌的乳制品有利于人的健康長壽[4]，乳酸菌對機體的免疫反應、腫瘤發生、衰老過程和應激反應等發生作用[5]，有專家指出氧化應激與慢性疾病和機體衰老密切相關，如何增強機體的抗氧化能力預防疾病與衰老，成為研究的熱點課題之一[6]。食用必需量的天然抗氧化劑可有效預防氧化應激，乳酸菌（Lactobacillus，LAB）作為一種優質天然抗氧化劑，其抗氧化功能備受關注。結合乳酸菌具有的保健特性和天然無毒、能貫穿食品加工過程等的特點，勢必成為人們首先考慮的新型抗氧化劑[7]。

本試驗以大連工業大學大連益生菌功能特性研究重點實驗室從健康人糞便中分離出的7 株植物乳桿菌為對象，通過對其抗氧化能力的測定，篩選具有抗氧化活性的乳桿菌并分析乳桿菌可能的的抗氧化機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）和大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）為大連工業大學大連市益生菌功能研究重點實驗室保存菌株；MRS 肉湯培養基（生物試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；過氧化氫：天津市科密歐化學試劑有限公司；氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷：國藥集團化學試劑有限公司；二苯基苦基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazy1，DPPH）、鄰二氮菲、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸：美國SIGMA 公司；無水乙醇、硫酸亞鐵、三氯化鐵：天津市大茂化學試劑廠；抗壞血酸（VC）：天津市津科精細化工研究所；以上試劑均為分析純。T-AOC 試劑盒、SOD試劑盒、GSH 試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器設備

KG-SX-500 滅菌鍋：上海精密實驗設備有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；FQC 生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；S210-k 精密pH 計：梅特勒-托利多儀器有限公司；1510 酶標儀：美國Thermo Fisher Scientific 公司；CKX41 倒置電子顯微鏡：日本OLYMPUS 公司；Z326K型冷凍離心機：德國HERMLE Labortechnlk GmbH；AW200SG 型厭氧工作站：英國Electrotek 公司；超聲波細胞破碎機（Scientz-IID）：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 健康人類糞便中乳桿菌的篩選

取近期未食用含乳酸菌食物或藥物的健康人（年齡18～25 歲）的糞便0.5 g～1 g，置于滅菌后的4.5 mL濃度為0.9%的生理鹽水中，用無菌生理鹽水進行10 倍梯度稀釋，采用涂布平板法，分別取10-4、10-5、10-6系列稀釋液各100 μL 涂布在無菌MRS 瓊脂培養基平板上，于37 ℃的厭氧工作站（氣體組成：10%氫氣，10%二氧化碳和80%氮氣）培養48 h。待長出菌落，在MRS平板上劃線純化，于37 ℃的厭氧培養箱培養。選取接觸酶陰性和革蘭氏陽性菌作為備選菌株，進行16S rDNA 測序鑒定。并對菌種凍存保藏。

1.3.2 乳酸菌的培養及菌體、無細胞提取物的制備

根據黃玉軍等[8]報道的方法制備菌體及無細胞提取物。備選菌株按2%（體積分數）比例接種于MRS 培養液，于37 ℃培養18 h；菌株連續活化兩代后，按2%（體積分數）接種量接種于5 mL MRS 液體培養基中，置于37 ℃恒溫培養箱中孵育24 h。在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集菌體。將離心后的菌體用pH7.40 的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3 次后，重懸于PBS 中，調整菌數至109CFU/mL（OD600nm≈0.7），得到待測菌體，然后將菌數為109CFU/mL的菌體，超聲波冰浴破碎細胞（工作時間6 s，間隔時間9 s，10 min，輸出功率200 W），在10 000 r/min，4 ℃離心10 min，上清液即為無細胞提取物并放于-20 ℃保存。

1.3.3 清除DPPH 自由基能力的測定

采用Mu 等[9]報道的方法測定備選菌株菌體和無細胞提取物的清除DPPH 自由基能力。DPPH 溶于無水乙醇，濃度為0.2 mmol/L；將1 mL 備選菌株菌懸液（或無細胞提取物）加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH，室溫20 ℃下避光反應30 min，4 000 r/min 離心10 min，于517 nm 處測定上清液的吸光度。

樣品對DPPH 的清除率/%=[1-（Ai-A）j/A）c]×100

式中：Ai為1 mL 的DPPH+1 mL 樣品的吸光度；Aj為1 mL 無水乙醇+1 mL 樣品的吸光度；Ac為1 mL DPPH+1 mL 無水乙醇的吸光度。

1.3.4 對不同濃度H2O2溶液耐受能力的測定

參照Mu 等[9]報道的方法測定試驗菌株對不同濃度H2O2溶液的耐受能力。在無菌的MRS 培養液中加入不同體積的20 mmol/L H2O2溶液，總體積為5 mL，使過氧化氫的終濃度為0、0.4、0.8、1.0 mmol/L。按2%的接種量加入MRS 培養液，37 ℃厭氧培養8 h，在600 nm 波長下測定培養液吸光度值。吸光度值越大說明菌液濃度越大，從而判定試驗菌株對H2O2溶液耐受能力。

1.3.5 清除羥自由基（·OH-）能力的測定

參照Mu 等[9]報道的方法測定備選菌株對·OH-的清除作用，略有修改。反應混合物含有1.0 mL PBS（0.02 mol/L，pH 7.4），0.5 mL 鄰二氮菲（2.5 mmol/L），0.5 mLFeSO（42.5 mmol/L），0.5 mL H2O（220 mmol/L）和0.5 mL 菌體或無細胞提取物，在37 ℃水浴反應1.0 h，將混合液4 000 r/min 離心10 min，于536 nm 處測定吸光度。空白管用蒸餾水代替。樣品為按1.3.2 方法制備的7 株試驗菌株及陰陽性對照菌大腸桿菌、LGG 的菌體及無細胞提取物。

自由基的清除率/%=（A樣品－A對照）（/A空白－A對照）×100

式中：A對照為不加樣品，加入H2O2的吸光度；A空白為不加樣品，不加H2O2的吸光度；A樣品為加入樣品和H2O2的吸光度。

1.3.6 清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測定

參照張江巍等[3]報道的方法測定備選菌株菌體或無細胞提取物清除超氧陰離子自由基的能力。在離心管中依次加入2 mLTris-HCl 緩沖液（150 mmol/L，pH=8.20），0.6 mL 樣品（109CFU/mL），對照組加入PBS，25 ℃恒溫預熱10 min，最后加入25 ℃預熱后的1.2 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.4 mL（用10 mmol/L HCl 溶液配制），混勻后25 ℃恒溫水浴反應20 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液在325 nm 處測吸光度，試驗做3 個平行，重復2 次，求平均值。樣品為按1.3.2 方法制備的7 株試驗菌株及陽性對照菌LGG 的菌體及無細胞提取物。

超氧陰離子自由基清除率/ %=[1－（OD1－OD2）/（OD2－OD4）]×100

式中：OD1為含樣品和鄰苯三酚的吸光度；OD2為含樣品不含鄰苯三酚的吸光度；OD3為不含樣品含鄰苯三酚的吸光度；A4為不含樣品和鄰苯三酚的吸光度；

1.3.7 總還原力的測定

參照Wu 等[10]報道的方法測定備選菌株菌體或無細胞提取物的總還原能力。反應體系中加入待測樣品0.5 mL、1%鐵氰化鉀0.5 mL、0.2 mol/L（pH=6.60）PBS 0.5 mL 于10 mL 離心管中50 ℃水浴20 min，急速冷卻后，加入10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）0.5 mL，3 500 r/min 離心10 min。吸取上清液1 mL，加入0.1%的FeCl3溶液1 mL 于700 nm 處測定吸光度值。以PBS代替菌液作空白對照。樣品為按1.3.2 方法制備的7株試驗菌株及陽性對照菌LGG 的菌體及無細胞提取物。

還原能力/%=（As-Ap）/Ap×100

式中：As為樣品的吸光度；Ap為空白的吸光度。

1.3.8 總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）的測定

根據備選菌株DPPH 自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除能力、耐受過氧化氫及還原能力，篩選獲得抗氧化指標較高的菌株，進行后續試驗。

選用南京建成總抗氧化能力試劑盒[11]對菌株2號、3 號及陽性對照菌LGG 的菌體和無細胞提取物進行檢測。

總抗氧化能力/mL=（測定OD值－對照OD值）×反應量總量×樣本測試前稀釋倍數（/0.01×30×取樣量）

1.3.9 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測定

采用試劑盒檢測菌株2 號、3 號及陽性對照菌LGG 的無細胞提取物的超氧化物歧化酶（SOD）活力，方法及試劑的配制參照產品說明進行。

SOD 抑制率/%=（[A對照－A對照空白）－（A測定－A測定空白）]/（A對照－A對照空白）×100%

OD活力（/U/mL）=SOD 抑制率/50%×反應體系稀釋倍數×0.24 mL×樣品測試前稀釋倍數（5 倍）1.3.10 微量還原型谷胱甘肽（micro reduced glutathione，GSH）含量的檢測

本試驗選用GSH 試劑盒檢測菌株2 號、3 號及陽性對照菌LGG 的無細胞提取物的含量，方法及試劑的配制參照產品說明進行。

GSH 含量/（μmol/L）=[（測定OD值－對照OD值）/（標準OD值－空白OD值）×標準管濃度（20 μmol/L）×樣品前處理稀釋倍數（5 倍）]

1.4 數據處理

試驗所得數據用SPSS 20.0 軟件進行方差分析，差異顯著性檢驗采用獨立樣本t 檢驗和單因素方差分析（ANOVE，LSD）。所有數據均用平均值±標準誤差表示，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌菌株的菌落形態及鑒定結果

本研究從2 份健康人糞便中分離出7 株符合乳酸菌特性的桿菌，編號分別為1、2、3、4、5、7、8。7 株乳酸菌的外觀形態均為表面光滑、濕潤，邊緣整齊或略微凸起的乳白色不透明菌落，經革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶實驗呈陰性，可初步認定為乳桿菌。經過16S rDNA 測序鑒定，確定7 株為植物乳桿菌。鑒定結果如表1。

表1 菌種鑒定結果Table 1 Strains of appraisal results

2.2 DPPH 自由基清除能力的測定

分別測定7 株備選菌株的菌體和無細胞提取物對DPPH 自由基的清除率，以VC為對照，結果見表2。

由表2可知，7 株植物乳桿菌的菌體及無細胞提取物對DPPH 自由基均有一定的清除能力，但菌體的DPPH 自由基清除能力均明顯大于無細胞提取物的清除能力，菌體的清除率達18.12%～30.35%，無細胞提取物的清除率達7.55%～12.07%。VC的清除能力最強。大腸桿菌對DPPH 自由基清除率高的主要原因是大腸桿菌是一種過氧化氫酶陽性菌，在其細胞中含有內源過氧化氫酶。以上結果與楊靜秋[12]的研究結果相似，完整菌體清除DPPH 自由基的活性較高，因此可以初步推測乳酸菌清除DPPH 的活性物質主要存在于菌體表面和代謝產物中，而不是細胞內[13]。有報道顯示，乳酸菌具有DPPH 自由基清除活性可能和菌體產生的胞外多糖有關，Xu 等[14]的研究顯示DPPH 自由基的清除活性與由雙歧桿菌分離出的胞外多糖的濃度呈正相關。

表2 不同菌株對DPPH 自由基的清除能力Table 2 DPPH free radical scavenging ability of different strains

2.3 乳桿菌對不同濃度過氧化氫溶液的耐受能力

備選菌株分別接種于含有不同濃度的過氧化氫MRS 培養基中，檢測培養8 h 后培養液在600 nm 處的吸光度值，評價菌株對過氧化氫的耐受能力，結果見表3。

由表3可知，隨著過氧化氫濃度的增加，接種不同菌株MRS 培養液的吸光度值均有不同程度下降，說明過氧化氫對菌株產生了氧化損傷。當培養液中過氧化氫濃度為1.0 mmol/L 時，接種菌株2、4 及對照菌株培養液的吸光度值無顯著差異，而接種菌株1、3、7 的培養液吸光度值顯著高于接種LGG 吸光度值，說明菌株1、3、7 對濃度為1.0 mmol/L 過氧化氫具有較強耐受性。該結果與車馳等[15]的研究結果一致，結果表明，8 株乳桿菌對不同濃度的過氧化氫都有一定的耐受能力，但不同菌株的耐受能力不同。

表3 含有H2O2 培養基中乳桿菌的菌體濃度（OD600）Table 3 Cell concentration of Lactobacillus containing H2O2 medium

2.4 羥自由基（OH·）清除能力的測定

備選菌株的菌體及無細胞提取物對羥自由基的清除能力結果見表4。

表4 不同菌株對羥自由基的清除能力測定Table 4 Determination of scavenging ability of hydroxyl free radicals by different strains

由表4可知，7 株菌株對羥自由基均有一定的清除作用。其中1、2、3 號菌株的菌體清除率較高，與兩株對照菌株之間存在顯著差異（p＜0.05）。2、3 號菌株的無細胞提取物的清除率與陽性對照菌株LGG 無顯著差異，與陰性對照（大腸桿菌）之間差異顯著（p＜0.05）。此外，在此試驗條件下發現1、2、3、5、7 號菌株及陰性對照大腸桿菌的菌體羥自由基清除率均高于其無細胞提取物，然而4、8 號菌及LGG 3 株菌的菌體羥自由基清除率均低于其無細胞提取物。劉少敏[16]研究了嗜酸乳桿菌（Lactobacillius acidophilus）NCFM，植物乳桿（Lb.plantarum）ATCC 14917，鼠李糖乳桿菌（Lb.rhamnosusGG，LGG）和植物乳桿菌（Lb.plantarum）NDC 75017 對羥自由基清除能力的影響，發現LGG 的羥自由基清除能力最強。羥自由基能夠降解DNA，損傷細胞膜和多糖化合物，是最主要的能夠導致脂質過氧化和多種人體細胞損傷的自由基[17]。乳酸菌菌體具有較強的羥自由基清除能力可歸結為在乳酸菌細胞內存在著針對Cu2+和Fe2+的天然螯合物質，Cu2+和Fe2+能夠參與到機體多種氧化過程中，因此乳酸菌對Cu2+和Fe2+的螯合作用，能夠從根本上減少羥自由基的產生[18]。本研究中備選菌株對Cu2+和Fe2+的螯合作用還有待進一步研究。

2.5 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測定

備選菌株的菌體及無細胞提取物對超氧陰離子自由基清除能力的測定結果見表5。

表5 同等濃度的不同菌株對O2-·的清除能力Table 5 The same concentration of different strains of O2-free radicals scavenging ability

由表5可知，在濃度為109cfu/mL 時，無細胞提取物對超氧陰離子自由基的清除率均高于菌體，其中菌株5、8 與陽性對照菌株LGG 菌體之間無顯著差異。其余菌株的菌體清除率與對照之間差異顯著（p＜0.05）。所有菌株的無細胞提取物的清除率與陽性對照之間無差異顯著。所有菌株的菌體及無細胞提取物均具有大于50%的超氧陰離子自由基清除能力。乳酸菌菌體及無細胞提取物具有超氧陰離子自由基清除能力可能是由于其菌體細胞及代謝產物中存在各種各樣的氧化酶，有報道顯示，乳酸菌存在不同的活性氧族（reactive oxygenspecies，ROS）解毒機制，包括過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和各種各樣的氧化酶[12]。

2.6 總還原力的測定

備選菌株的菌體及無細胞提取物的總還原能力的測定結果見表6。

表6 乳酸菌總還原能力的測定Table 6 Total reducing capacity determination of lactic acid bacteria

由表6可知，各菌株菌體的還原能力均強于無細胞提取物，菌株2 的菌體及無細胞提取物的還原能力最強，分別為39.64%、27.58%，且與對照組無顯著差異，其余除3 號菌的無細胞提取物外，菌體和無細胞提取物的還原能力均與對照組差異顯著（p＜0.05）。說明乳酸菌具有還原能力的活性物質的含量不僅在不同菌株間具有差異，在乳酸菌不同部位也存在較大差異。菌株無細胞提取物各抗氧化指標均低于完整菌體，也可能是由于超聲破碎使部分發揮抗氧化活性的細胞物質失活。Lin 等[19]在對19 株乳酸菌無細胞提取物進行抗氧化試驗時發現，受試的19 株菌均具有還原能力。

2.7 總抗氧化能力（T-AOC）的測定

經過測定7 株備選菌株對3 種自由基清除能力、過氧化氫耐受能力以及總還原力，結果表明菌株2 的菌體對DPPH 自由基的清除率高達到30.35%，對羥自由基的清除率達41.35%，還原能力高達39.64%，高于試驗所用其他菌株，無細胞提取物對羥自由基的清除率高達到31.50%，與陽性對照菌株LGG 無顯著差異。菌株3 對3 種自由基的清除率較高，處于較穩定的狀態。從而挑選出2、3 號菌株進行總抗氧化能力、SOD 和GSH 酶活性的研究。

2、3 號及LGG 菌株的菌體及無細胞提取物的總抗氧化能力的測定結果見表7。

表7 總抗氧化能力測定Table 7 Total antioxidant capacity determination

由表7可知，菌株2 的菌體的總抗氧化能力與菌株LGG 無顯著差異，但無細胞提取物的總抗氧化能力顯著（p＜0.05）高于LGG 無細胞提取物總抗氧化能力。陳明[20]研究了不同植物乳桿菌的總抗氧化能力，發現無論是在發酵上清液還是在無細胞提取物中菌株BX62、24-7 和XM5 都具有較高的T-AOC 活性。

2.8 超氧化物歧化酶（SOD）活力的測定

對篩選出來的2、3 號菌及LGG 菌株的無細胞提取物進行SOD 活性測定，結果見表8。

本反應體系中SOD 抑制率為50%時所對應的酶量為一個SOD 活力單位（U）。菌株3 的SOD 抑制率和SOD 活力最強。但3 種菌株SOD 抑制率和SOD 活力無顯著差異（p＜0.05）。張江巍等[2]篩得的抗氧化乳酸菌L4 具有SOD 活性；大多數乳酸菌是通過產生超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶清除羥自由基和過氧化氫[21-24]。Lee 等[25]為探索乳酸菌抗氧化機制，測定了菌株L．plantarumKCTC 3099 螯合金屬離子及SOD 活性，結果表明受試菌SOD 活性極低，但螫合Fe2+、Cu2+的能力分別為13.6 mg/kg 和23.9 mg/kg，因此推斷乳酸菌抗氧化能力來自于菌體螯合金屬離子的能力。

表8 SOD 活力的測定Table 8 Determination of SOD activity

2.9 微量還原型谷胱甘肽（GSH）含量的檢測

對篩選出來的2、3 號及LGG 菌株的無細胞提取物進行GSH 含量測定，結果見表9。

表9 還原型谷胱甘肽（GSH）的測定Table 9 Determination of reduced glutathione（GSH）

由表9可知，所有菌株均存在GSH，3 株菌GSH含量差異不顯著。谷胱甘肽過氧化物酶是一種重要的催化過氧化氫分解的酶，它的作用是保護細胞膜結構和功能的完整延遲細胞的衰老，也具有一定的清除O2－·的能力[26]。GSH 具有清除自由基和抗氧化作用，如體內產生的過氧化氫、氫過氧化物（ROOH）、過氧化物自由基（R·）等均能被清除[27]。很多研究認為，乳酸菌的抗氧化作用是由胞內抗氧化成分和氧化還原調控系統共同調節完成的，乳酸菌自身能產生GSH 和SOD等抗氧化酶和非酶類抗氧化劑，也可通過菌體產生的代謝產物調節氧化還原電位而清除自由基，降低氧化應激[28]。

3 結論

本研究結果表明篩選出的2 號及3 號植物乳桿菌具有抗氧化活性。乳酸菌完整菌體與無細胞提取物抗氧化活性的不同，可能與超聲處理對菌體活性成分的影響有關，完整活菌體狀態下，菌體表面成分、細胞內容物均參與清除自由基等抗氧化的過程。本研究中抗氧化活性隨菌體及試驗方法的不同而不同，因此有必要進行細胞試驗及動物試驗，驗證菌株的抗氧化性能。