4種茶葉水提物及茶多酚的體外抗氧化性能研究

馬慧，茹鑫，王津，趙路漫，王碩，*

（1.南開大學醫學院，天津市食品科學與健康重點實驗室，天津300350；2.上海康識食品科技有限公司，上海201103）

茶起源于中國，是世界上僅次于水的第二大飲品，其發揮的益處被廣泛熟知，深受人們的喜愛。茶多酚是茶葉或茶飲料中的重要活性成分，是茶葉中酚類及其衍生物的總稱，茶多酚主要包括黃烷醇類（兒茶素類）、花色苷類、黃酮及黃酮醇類、酚酸及縮酚酸類等化合物。根據不同的制造工藝，茶可分為未發酵茶（綠茶）、半發酵茶（烏龍茶）、全發酵茶（紅茶）和后發酵（黑茶）[1]。總體上全球綠茶年產量約為20%，烏龍茶約為2%，紅茶約為78%[2]。茶葉中的茶多酚主要是兒茶素類，包括（-）-表兒茶素[（-）-epicatechin，EC]、（-）-表沒食子兒茶素沒食子酸酯[（-）-epigallocatechin gallate，EGCG]、（-）-表沒食子兒茶素[（-）-epigallocatechin，EGC]和（-）-表兒茶素沒食子酸酯[（-）-epicatechin gallate，ECG]和少量的其他兒茶素。不同茶葉的兒茶素組成和數量不同，一般來說，綠茶含有高水平的兒茶素單體，占所有酚類化合物的80%～90%，然而在發酵之后，紅茶中的兒茶素單體含量僅占20%～30%，兒茶素聚合物即茶黃素和茶紅素占紅茶的60%～70%[3-4]。烏龍茶中單體和多聚體形式的兒茶素含量處于紅茶和綠茶之間。隨著國內外研究人員對茶多酚研究的不斷深入，已發現茶多酚具有多種生物活性作用，包括抗輻射、抗炎癥和抑菌等特性，在預防神經退行性疾病、代謝性疾病和癌癥等方面也具有潛在的作用[5]，而抗氧化能力是茶多酚發揮多種功效的核心。

茶多酚是重要的天然抗氧化劑，本文以4種茶葉為原料，比較4種茶葉水提物的抗氧化性及與總酚、兒茶素含量的相關性，并對比分析不同濃度下茶多酚與VC的抗氧化能力，為茶多酚的開發利用提供體外試驗參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高效液相色譜標準品：沒食子酸（gallic acid，GA）、（+）-兒茶素[（+）-catechin，C]、EC、EGC、EGCG、ECG、（-）-沒食子兒茶素[（-）-gallocatechin，GC]、（-）-兒茶素沒食子酸酯[（-）-catechin gallate CG]、（-）-沒食子兒茶素沒食子酸酯[（-）-gallocatechin gallate，GCG]、茶多酚：維克奇生物科技有限公司；Vc：德國DRE 公司；DPPH、2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2-azino-bis （3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）：北京索萊寶科技有限公司。以上試劑均為分析純。

紅茶：云南大葉種；烏龍茶：福建大白毫；綠茶：浙江武陽早；茉莉茶：廣西大葉種。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（UV-1800）、高效液相色譜儀器（LC-20A）：日本島津儀器公司；酶標儀（Varioskan LUX）：賽默飛世爾科技有限公司；數顯磁力攪拌水浴鍋（HH-6SC）：常州普天儀器制造有限公司；高速離心機（Allegra 64R）：貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉水提物的制備

取適量紅茶、烏龍茶、綠茶以及茉莉花茶，用粉碎機研磨成粉末，分別取0.5 g 固體茶葉粉末于50 mL 離心管中，再以1 ∶50（g/mL）的料液比倒入煮沸后的雙蒸水，每一個樣品設立3 個平行，然后將離心管統一放入恒溫水浴鍋中，提取溫度為85 ℃，提取時間為10 min，在此過程中用錫箔紙包住以避光，并加以恒定轉速磁力攪拌，以進行充分提取。提取完之后將離心管取出，冷卻至室溫，之后以5 000 r/min 轉速4 ℃離心10 min，將上清液即茶葉水提物分裝，分別置于4 ℃及-20 ℃，密封避光保存，便于進行之后的分析。

1.3.2 茶葉水提物中總酚含量的測定

參考GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》，采用福林酚（Folin-Ciocalteu）試劑比色法測定茶葉中茶多酚的總量，在765 nm 波長條件下用分光光度計測定吸光值A，結果表示為每毫升樣品提取物中沒食子酸微克數[6]。

1.3.3 茶葉水提物中兒茶素含量的測定

兒茶素含量采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 分 析， 使 用Agilent ZORBAX SB-AQ 色譜柱，流動相A 為水，流動相B 為乙腈，流動相A 與B 都加入終濃度為0.2%乙酸作為穩定劑，柱溫：35 ℃，檢測波長：270 nm，流速：1 mL/min，進樣量為20 μL，洗脫梯度為：10 min～15 min：3%B～10%B；15 min～20 min：10%B～20%B；20 min～25 min：20%B～25%B；25 min～30 min：25%B～30%B；30 min～35 min：30%B～35%B；35 min～40 min：35%B～3 %B；40 min～45 min：3%B，檢測茶葉中GA、C、EC、EGC、EGCG、ECG、GC、CG 以及GCG 的含量，制作9 個單體的標準曲線。

1.3.4 抗氧化能力測試

分別準確稱量50mg 茶多酚與VC，配制成1.0mg/mL的母液，然后稀釋為終濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的溶液，進行抗氧化能力比較，同時對4種茶葉水提物的抗氧化能力進行測試。

1.3.4.1 ABTS+·清除能力測定

ABTS 在適當的氧化劑作用下氧化成綠色的ABTS+·，在抗氧化物存在時，ABTS+·的產生會被抑制，在734 nm 測定吸光度即可測定并計算出樣品的總抗氧化能力。配制終濃度為7 mmol/L ABTS 和2.45 mmol/L過硫酸鉀的混合液，室溫避光條件下靜置過夜12 h，制得ABTS+·儲存液，使用時用PBS 稀釋至734 nm 處吸光度為0.70±0.05 的溶液，取0.1 mL 的樣品與3.9 mL 稀釋過的ABTS+·溶液在避光下反應5 min，用雙蒸水作對照，在734 nm 處測吸光值A[7]。

ABTS+·清除率/%=（1-A樣品/A對照）×100

1.3.4.2 DPPH 自由基清除能力

DPPH 自由基在有機溶劑中是一種穩定的自由基，其醇溶液呈紫色，且需低溫避光儲藏，具有單一電子，故能接受一個電子或氫離子，在波長為517 nm 下具有最大吸收。有自由基清除劑存在時，DPPH 自由基的單電子被捕捉而使其顏色變淺，在最大光吸收波長處的吸光值下降。用無水乙醇配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH 溶液，取2 mL 不同濃度的樣品與2 mL DPPH溶液混合均勻后，室溫避光下反應30 min，在517 nm處測吸光值A[8]。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A樣品-/A空白）A對照]×100

1.3.4.3 FRAP 法測定總抗氧化能力

按照T-AOC 試劑盒說明書進行檢測，在酸性環境下，還原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）產生藍色的Fe2+-TPTZ 的能力反映了總抗氧化能力，先配制不同濃度的Fe2+-TPTZ 溶液，在λ 為593 nm 處測吸光值A，制作標準曲線，樣品的抗氧化能力以達到同樣吸光度變化值（△A）所需的標準液離子濃度表示。

2 結果與分析

2.1 茶葉水提物總酚含量及兒茶素含量

4種茶葉水提物總酚含量見表1。

表1 4種茶葉水提物總酚含量Table 1 Total polyphenol contents of four kinds of tea water extracts

根據表1可以看出，4種茶葉水提物中烏龍茶所含的總酚含量最高，其次是茉莉花茶、綠茶，最后是紅茶。各類茶葉水提物總酚含量及各組分含量不同主要與其加工方式有關，本試驗樣品分別屬于不發酵茶，半發酵茶及發酵茶，綠茶和茉莉花茶屬于不發酵茶，烏龍茶屬于半發酵茶，紅茶屬于發酵茶，除了紅茶外，另外3 種茶在加工過程中都要經過殺青步驟，這一步通過高溫使得多酚氧化酶失活，因此總酚含量比較高，而紅茶則未經殺青，經過萎凋，再揉捻或揉切、發酵等步驟，不斷氧化聚合，形成茶黃素或茶紅素等酚類氧化聚合物，因此酚類含量較低[9]。

4種茶葉水提物兒茶素含量見圖1。

圖1 4種茶葉水提物兒茶素含量Fig.1 Catechin content of four kinds of tea water extracts

由圖1可以計算出兒茶素總量由高到低依次為茉莉花茶（2 396.472 μg/mL）、烏龍茶（2 386.404 μg/mL）、綠茶（2 235.539 μg/mL）及紅茶（867.901 μg/mL），與總酚含量趨勢基本一致。在各個兒茶素單體中，EGCG 含量最高，4種茶葉所含的EGCG 含量大小為茉莉花茶＞綠茶＞烏龍茶＞紅茶，而含有GA 的順序為紅茶＞烏龍茶＞綠茶＞茉莉花茶。紅茶中的沒食子酸含量略高，可能是制作過程中酚類物質降解造成的，另外不同產地、不同季節采摘等因素都會對其品質有所影響。

2.2 4種茶葉水提物抗氧化能力及相關性分析

本試驗采用3 種常見的抗氧化能力測試方法對4種茶葉水提物的體外抗氧化能力進行評估，其結果如表2所示。

表2 4種茶葉水提物抗氧化能力Table 2 Antioxidant capacity of four kinds of tea water extracts

整體上不發酵或半發酵茶的抗氧化能力高于發酵茶的抗氧化能力，在ABTS 法測抗氧化活性試驗中，紅茶ABTS+·清除能力較高，為84.32%，而烏龍茶、綠茶、茉莉花茶的ABTS+·清除率無顯著性差異（P＞0.05），分別為83.26%、83.40%、83.26%；在DPPH 法測抗氧化活性試驗中，烏龍茶的DPPH·清除率達到93.90%，茉莉花茶和綠茶次之，分別為93.03%、92.50%，紅茶DPPH·清除率較低為89.09 %，4種茶葉的DPPH·清除能力具有顯著性差異（P＜0.05）；FRAP 法測抗氧化活性試驗結果，以達到同樣吸光度變化值的Fe2+濃度表示，4種茶葉水提物的抗氧化能力順序依次為綠茶（0.879 0 μmol/mL）＞烏龍茶（0.870 5 μmol/mL）＞茉莉花茶（0.822 6 μmol/mL）＞紅茶（0.455 2 μmol/mL），且綠茶、烏龍茶及茉莉花茶并無顯著性差異（P＞0.05）。

將抗氧化能力測試結果與總酚含量（total phenolics，TP）或各個兒茶素單體含量進行相關性分析，結果如表3所示。

表3 總酚及兒茶素單體含量與不同抗氧化能力測試的相關性分析Table 3 Correlation coefficients amongst TP，catechins and the antioxidant capacities determined by different types of assays

ABTS 法抗氧化能力值與總酚含量（r=-0.801）、GC（r=-0.907）、EGC（r=-0.911）、EGCG（r=-0.927）、ECG（r=-0.804）顯示極強負相關，而與GA（r=0.859）、CG（r=0.776）含量呈現極強正相關；而DPPH 法抗氧化測試值與總酚含量（total phenolics，TP）（r=0.891）、GC（r=0.971）、EGC（r=0.967）、EGCG（r=0.907）、ECG（r=0.877）顯示極強的正相關，與CG（r=-0.787）顯示強負相關；FRAP 法測定的抗氧化能力結果與GC（r=0.948）、EGC（r=0.942）、EGCG（r=0.950）、ECG（r=0.967）含量呈極強正相關，與EC（r=-0.713）、GCG（r=-0.777）呈強負相關。其中總酚含量與DPPH 自由基清除能力以及FRAP 與EGCG 含量的正相關關系，也在LvHP等的研究中有所報道[10]，值得注意的是，ABTS 與EGCG含量呈現極強負相關，與Wu Z 等報道的結論[11]正好相反，兒茶素總量與DPPH 與FRAP 法呈現極強正相關，與高玉萍等結果一致[12]，但是與ABTS 法呈現極強負相關。不同的兒茶素結構不同，對不同自由基反應不同，這可能是影響不同茶葉水提物抗氧化能力高低的主要原因，另外茶葉水提物含有的除了兒茶素之外的其他物質也會不同程度地影響其抗氧化能力，具體的原因有待進一步研究分析。

2.3 茶多酚與VC的抗氧化能力比較

本試驗采用3 種抗氧化能力測試法對茶飲料中VC和茶多酚常見濃度水平（0～1 mg/mL）進行比較，得到的結果如圖2、圖3、圖4所示。

圖2 茶多酚與VC對ABTS+·清除率的比較Fig.2 Comparations of ABTS cation radical scavenging capacity of tea polyphenols and VC

總體上同濃度的茶多酚抗氧化能力高于VC，在ABTS 法比較抗氧化能力試驗中，在低濃度即0～0.4mg/mL范圍內，茶多酚抗氧化活性高于VC，而0.4mg/mL～1mg/mL濃度范圍內，二者抗氧化活性均保持較高水平，無顯著性差異；DPPH 法比較抗氧化能力試驗中，在所測試的范圍內，茶多酚與VC的抗氧化能力處于較高水平，其中茶多酚DPPH·清除值略低于VC，可能由于茶多酚本身為淡黃色，造成一定的背景干擾有關；在FRAP 法測茶多酚與VC的抗氧化能力試驗中，茶多酚和VC的抗氧化能力均隨濃度的增大而增加，且茶多酚的FRAP值始終高于VC。

圖3 茶多酚與VC對DPPH 自由基清除率的比較Fig.3 Comparations of DPPH radical scavenging capacity of tea polyphenols and VC

圖4 茶多酚與VC對鐵離子還原抗氧化能力的比較Fig.4 Comparations of ferric reducing antioxidant potential（FRAP）of tea polyphenols and VC

3 結論

本試驗結果表明，不同的茶葉水提物均有很強的體外抗氧化活性，且對不同的抗氧化能力測試方法中的自由基或離子反應不同，因此在對某一活性物質進行抗氧化能力評價時，要綜合多種方法。總體上，不發酵茶及半發酵茶的抗氧化能力高于發酵茶，綠茶、茉莉花茶、烏龍茶的DPPH 法及FRAP 法抗氧化活性測試結果優于紅茶，4種茶葉的ABTS 法抗氧化活性測試結果均處于較高水平，且紅茶的ABTS+·清除率略高于其他3 種茶。ABTS 法抗氧化能力值與總酚含量、GC、EGC、EGCG、ECG 顯示極強負相關，而與GA、CG 含量呈現極強正相關；而DPPH 法抗氧化測試值與TP、GC、EGC、EGCG、ECG 顯示極強的正相關，與CG 顯示強負相關；FRAP 法測定的抗氧化能力結果與GC、EGC、EGCG、ECG 含量呈極強正相關，與EC、GCG 呈強負相關，另外兒茶素總量與DPPH 與FRAP 法呈現極強正相關，證明茶葉水提物中的兒茶素在這兩種抗氧化活性測試中發揮重要作用，相反兒茶素總量與ABTS 法呈現極強負相關，茶葉水提物成分復雜，多酚類物質除兒茶素之外，還有槲皮素、山柰酚等，并且水提物中還有茶多糖、茶氨酸等物質，影響其抗氧化能力。

VC因其抗氧化性而廣泛應用于食品加工制作中，本試驗將茶多酚與VC的抗氧化能力進行比較，結果發現同濃度的茶多酚抗氧化能力高于VC，在ABTS 法比較抗氧化能力試驗中，在低濃度即0～0.4 mg/mL 范圍內，茶多酚抗氧化活性高于VC，而0.4 mg/mL～1 mg/mL濃度范圍內，二者抗氧化活性均保持較高水平，在DPPH法比較抗氧化能力試驗中，茶多酚與VC的抗氧化能力處于較高水平；在FRAP 法測茶多酚與VC的抗氧化能力試驗中，茶多酚和VC的抗氧化能力均隨濃度的增大而增加，且茶多酚的FRAP 值始終高于VC。表明茶多酚具有良好的抗氧化性能，為茶多酚作為抗氧化劑應用到食品加工中提供了一定的依據。