紅肉中N-羥乙酰神經氨酸在人體中的代謝途徑及危害

文琦，沈清武

（湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙410128）

70年前，貢納·布利克斯等發現腦糖脂與唾液黏蛋白經酸水解的主要產物為唾液酸[1]。這是一種具有9個碳骨架的酸性糖類，為神經氨酸的N-或O-取代衍生物的總稱。唾液酸常存在于N-聚糖、O-聚糖和神經節苷脂中糖鞘脂分支的末端，也存在于糖基磷脂酰肌醇錨著點（GPI anchors）的側鏈末端，構成單糖或多糖殘基[1-4]。

這一類單糖在生物多樣性方面有著巨大潛力。（1）碳鏈連接方式多樣。高能供體形式的唾液酸（cytidine monophospho-sialic acid，CMP-Sia）經過唾液酸轉移酶能與寡糖通過α2-3 方式連接。唾液酸也可在聚糖內自身聚合，一般為α2-8 唾液酸殘基連接方式形成唾液酸多聚體。在棘皮動物中，其他單糖（如海藻糖、半乳糖）可與唾液酸殘基的C-4 連接。（2）自然修飾多種多樣。例如，神經氨酸（Neuraminic acid，Neu）的C-5 連接氨基；2-酮基-3-脫氧-D-甘油-D-半乳糖酸（deaminoneuraminic acid，KDN）的C-5 連接羥基；N-乙酰神經氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）的C-5 連接N-乙?；?；當Neu5Ac 的N-乙酰基羥基化時，則形成Neu5Gc[5-6]。這4 個核心唾液酸分子（Neu5Ac、Neu5Gc、KDN 和Neu）可在C-4、C-7、C-8 和C-9 上攜帶一個或多個基團（O-乙酰、O-甲基、O-硫酸鹽、O-乳酸基或磷酸基）。此外，C-1 上的羧基通常與羥基相鄰的糖基凝聚成一個內酯，或者與C-5 中游離的氨基形成內酰胺?，F今已發現50 多種唾液酸，糖基末端的唾液酸殘基數量根據單糖、三糖、寡糖及多糖等聚合的不同程度而拓展到了400 個以上[7]。唾液酸的數目、自身聚合方式以及空間結構排列順序的多樣化，致使糖脂和糖蛋白的結構多種多樣，為發揮各自不同的生理功能奠定了基礎[8]。唾液酸在細胞外膜、溶酶體膜以及糖蛋白（如血蛋白和黏蛋白）中具有較高的表達量[1]，說明唾液酸能維持分子與細胞膜的穩定以及細胞與環境的平衡。此外，嬰兒飲食中需要補充唾液酸以達到最佳的大腦發育[9]；唾液酸能夠改善仔豬和大鼠的記憶、學習能力及腦唾液酸含量[10]。

Neu5Gc 于常態下為白色結晶粉末，帶有負電荷，與堿反應，易溶于水且微溶于甲醇，不溶于乙醚和石油。Neu5Gc 大多存在于碳水化合物中，具有廣泛的生物學作用：（1）Neu5Gc 是許多糖蛋白及糖脂的基本組成部分；（2）Neu5Gc 能調節血蛋白半衰期、中和毒素以及粘附細胞；（3）Neu5Gc 位于糖側鏈的非還原性末端，具有陰離子電荷，能發揮各種生理特異性作用[11-13]。Neu5Gc 既能掩蓋抗原位點、受體，又能作為各種微生物和動物凝集素的配體，并且Neu5Gc 上的化學修飾能影響這些功能（特別是配體功能)[1]。Neu5Gc 存在于大多數后口動物的非神經組織和體液中，例如脊椎動物、棘皮動物[14]，但不存在于正常人體組織中[15]。動物體內主要表達Neu5Ac 和Neu5Gc，Neu5Gc 大多數以雙唾液酸或寡唾液酸鏈形式連接在神經節苷脂或糖蛋白末端，一般為α2-8 或α2-5 寡糖連接的有利于胚胎的早期發育和抗微生物感染的多聚體Neu5Gc[8，16]。其中，α2-8 連接的Neu5Gc 含有2 個～3 個唾液酸殘基，在細胞黏附、分化、信號傳導等過程中充當信使，并在特異性抗原表面表達[17]。例如，缺乏Neu5Gc 將會導致胰島B 細胞功能障礙[18]。

1 Neu5Gc在人體內的代謝命運

1.1 人體無法自主合成Neu5Gc

除了膳食攝入的唾液酸，人類和其他哺乳動物都能利用糖酵解過程產物合成內源性唾液酸[15]。Neu5Ac是由胞質腔內的中性前體 N-乙酰甘露糖胺（Nacetylmannosamine，ManNAc）合成的[19]。ManNAc 的來源有兩種途徑，一種是由N-乙酰氨基葡萄糖（Nacetylglucosamine，GlcNAc）經過N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向異構酶（N-acetylglucosamine 2-epimerase，GNE）直接催化形成[20]；另一種是在N-乙酰葡萄糖胺激酶（N-acetylglucosamine kinase，GNK）、GNE 等一系列酶作用下實現了GlcNAc、二磷酸尿苷-N-乙酰氨基葡萄糖（uridine diphosphate-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）和ManNAc 之間的轉化。GNE 同時具備二磷酸尿苷-N-乙酰氨基葡萄糖-2-差向異構酶和N-乙酰甘露糖胺激酶活性。GNE 的異構酶功能將UDP-GlcNAc 轉化成ManNAc，其激酶活性使ManNAc磷酸化形成6-磷酸乙酰甘露糖胺，而后在N-乙酰神經氨酰酸合酶（N-acetylneuraminic acid phosphate synthase，NANS）的聚合作用下形成9-磷酸乙酰神經氨酸，再經 N-乙酰神經氨酰酸磷酸酶（Nacetylneuraminic acid phosphatase，NANP） 作 用 形 成Neu5Ac，以上都在胞漿中進行。隨后Neu5Ac 在細胞核中活化成單磷酸胞苷-N-乙酰神經氨酸（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid，CMP-Neu5Ac），最終由特定的轉運蛋白泵入高爾基體。在高爾基體中，CMP-Neu5Ac 向內質網中新合成的糖脂和糖蛋白提供唾液酸供體，在唾液酸轉移酶的作用下形成糖復合物，隨后進入細胞表面或從細胞中分泌出來。溶酶體室也可以釋放糖脂和糖蛋白中的唾液酸，然后被泵回細胞質，以重新利用產生細胞所需的糖復合物[1]。在非人類細胞中由于具有單磷酸胞苷-N-乙酰神經氨酸羥化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH），從而在線粒體外膜上進行CMPNeu5Ac 向CMP-Neu5Gc 轉化，而Neu5Gc 的后續命運與Neu5Ac 的循環和不同程度的重復利用相似[8]。

人類CMAH 基因缺失了一個外顯子，這導致了開放閱讀框被過早截斷，CMP-Neu5Gc 羥化酶由此失活，所以人體不具有從Neu5Ac 合成Neu5Gc 的能力[15]。這種變異發生在我們與類人猿的最后一個共同祖先之后，并且是目前已知的最早的人類與類人猿基因差異之一。這就是大多數哺乳動物體內都含有Neu5Gc 而人類沒有的原因。人類進化過程中，這類差別帶來了人類有別于其他物種的轉變。（1）與我們最近的進化親屬黑猩猩和大猩猩相比，人血細胞與血清蛋白缺乏Neu5Gc，并且積累了過量的Neu5Ac 前體[9]。（2）有研究指出在所有被研究動物的大腦中CMAH/Neu5Gc 的表達都被抑制了，包括那些在其他組織中CMAH/Neu5Gc 高表達的動物。由于人類譜系中Neu5Gc 的丟失可能早于人屬的出現，因此Neu5Gc 的缺失在某種程度上促進了人類大腦的進化[1]。（3）與CD33 相關的免疫球蛋白樣凝集素（siglecs）能與唾液酸選擇性結合，Neu5Gc 的缺失導致這些抑制分子能更好地與Neu5Ac 結合[1]。再者，惡性瘧原蟲（Pf）與賴氏瘧原蟲（Pr）是很難區別的，但是黑猩猩對Pr 易感，對Pf 不易感，人類則相反[21]。這是因為瘧原蟲侵入機體與EBA-175 蛋白有關，而Pf EBA-175 選擇識別Neu5Ac，Pr EBA-175 和紅細胞的結合與其對Neu5Gc 的識別有關，這說明人類和黑猩猩的差異進化及瘧疾易感性也與Neu5Gc 遺傳的丟失有關[21]。

圖1 N-乙酰甘露糖胺（ManNAc）合成途徑Fig.1 The synthesis of N-acetylmannosamine（ManNAc）

研究人員使用CMAH 基因敲除小鼠做實驗觀察，此種基因工程小鼠體內的CMAH 基因被敲除，不表達Neu5Gc，這種狀態下的小鼠與人體是相似的。飼喂CMAH 基因敲除小鼠不含Neu5Gc 的食物一段時間后，CMAH 基因敲除小鼠體內依然沒有Neu5Gc 的表達。接著按時飼喂CMAH 基因敲除小鼠含Neu5Gc 的食物一段時間后，小鼠體內檢測出Neu5Gc 及相應的anti-Neu5Gc 抗體，表明在哺乳動物體內不存在其他Neu5Gc 生物合成途徑[22]。因此，人體不能自主合成Neu5Gc，只能合成Neu5Ac，人體中的Neu5Gc 只有可能是外源性的。

1.3 人體對外源性Neu5Gc 的吸收

雖然人體不能自主合成Neu5Gc，但通過Neu5Gc與單特異性抗體（αNeu5Gc IgY）的免疫反應試驗發現它存在于人體脈管系統的內皮細胞、癌細胞、胎盤組織以及中空器官的上皮細胞中[23]。例如，在人類腫瘤中，聚糖形式的Neu5Gc 占有1%～3%[24]。與此同時，吃紅肉和其他哺乳動物食品的人每天將會攝入Neu5Gc，所以Neu5Gc 是通過人體代謝而被吸收利用的。

外源性Neu5Gc能通過2 種潛在途經合并到人體細胞中。（1）細胞攝取的糖脂或糖蛋白進入溶酶體室后，釋放Neu5Gc，在細胞質實現Neu5Gc 的再利用。Muriel Bardor 等用含Neu5Gc 的培養基培養人類上皮細胞，3 d 后檢測，發現細胞中含有Neu5Gc。Neu5Gc 通過胞飲作用進入溶酶體內后，溶解糖蛋白和糖脂釋放出Neu5Gc，并與相應受體結合進入到細胞液中[25]。（2）食物在腸道中分解產生的中性前體N-羥乙酰甘露糖胺（ManNGc）能通過被動擴散進入細胞，接著ManNGc轉化為Neu5Gc[26]。這2 種途徑都能有效地繞過人類的酶缺陷。

1.4 Neu5Gc的蓄積

Neu5Gc 能在人體中蓄積。細胞內唾液酸生物合成酶不能區分Neu5Gc 和Neu5Ac，外源性Neu5Gc 正是利用這種代謝“漏洞”對人體細胞的進行唾液酸化[27]。Nohle 等發現，給小鼠和大鼠喂食含放射性的游離態唾液酸基本上全部在尿液中檢出，而放射性唾液酸糖蛋白則沒有[28]，但在它們釋放的二氧化碳中出現了放射性信號，表明唾液酸糖蛋白被代謝了。Kalyan Banda 等通過CMAH 基因敲除小鼠模型探討了Neu5Gc 糖蛋白以及游離Neu5Gc 胃腸道代謝機制[10]。游離Neu5Gc 被CMAH 基因敲除小鼠吸收后迅速進入血液循環，1 h～2 h 后隨尿液排出。與此相反，Neu5Gc 糖蛋白可以進入小腸壁，在血液循環中穩定循環數小時，代謝合并到多個外周組織的糖蛋白和糖脂中，在肝臟、腎臟和小腸壁上均檢測出了結合態的Neu5Gc，從而最終證明Neu5Gc 可以從食物中被吸收代謝并進入到人體內。因此，含有糖基連接的Neu5Gc 糖蛋白是人體組織積累的飲食來源，而不是游離的Neu5Gc。健康人群研究表明，在人類食用Neu5Gc 之后，游離的Neu5Gc 在進入人體4 h～6 h 之后就被吸收或排泄出體外，并且僅在人的唾液和面部毛發中被檢測到少量的Neu5Gc。但是如果Neu5Gc 與糖蛋白或糖脂結合，就不容易被排泄出去，會在人體中不斷地積累[22]。此外，相較于正常無明顯疾病的人群來說，營養不良人群體內更容易蓄積Neu5Gc[29]。

2 Neu5Gc與紅肉的安全性

2.1 紅肉及其制品特異性致病觀點

Neu5Gc 曾被認為是人類的一種癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA），僅在胎兒和某些人類腫瘤以及腫瘤細胞系中表達。其實，Neu5Gc 也存在于人體正常組織中的血管或靠近血管部位，但腫瘤中Neu5Gc 的表達量明顯高于正常組織[30]。生長中的腫瘤具有高代謝，高度血管化、巨噬細胞增多等特點，這些惡性細胞與周圍正常細胞相比，可能會占用更多的Neu5Gc。此外，缺氧能上調溶酶體中唾液酸轉運體的基因表達，釋放游離唾液酸進入細胞質[31]。

紅肉及其制品對人體特異性致病[32]。2015年世界衛生組織下屬的國際癌癥研究機構將紅肉列為較可能的致癌物，將加工肉制品列為致癌物。Youngyo Kim 等對16 份隊列研究進行薈萃分析，得出結論：總肉（所有類型的肉）、紅色和加工肉類的攝入與代謝綜合征得病率呈正相關，而白肉的攝入與代謝綜合征得病率呈負相關[33]。Zhanwei Zhao 等對Pub Med 和EMBASE 上2016年9月以來發表的論文進行了系統回顧與薈萃分析，發現食用紅肉和加工肉類與直腸癌的患病風險無關，但與整體結直腸癌患病風險呈正相關[34]。短暫幾個星期的攝入Neu5Gc，Neu5Gc 所引發的人體炎癥反應能持續數年[35]。相對于白肉和植物食品，紅肉中特異性含有Neu5Gc，這也是與紅肉特異性相關的多種疾病的共同發病原因[36]。Neu5Gc 在紅肉中的含量大小依次為：牛肉＞豬肉＞羊肉＞兔肉[37]，并在豬的肝臟、腎臟、脾臟等多個器官中高水平表達[38]。而在所有組織器官中，骨骼肌和脂肪組織中的Neu5Gc 濃度最低[39]。

2.2 Neu5Gc 能激發人體免疫應答反應

Neu5Gc 是一種獨特的新型抗原，可以通過多種方式改變人體細胞表面。雖然它被細胞生化機制識別為“自我”，但它被免疫系統識別為“非自我”，因此成為了“外來自身抗原”[40]。在人靜脈注射抗血清或者被蛇咬等情況發生后，會產生針對Neu5Gc 這一特異抗原的“血清病”（Hangananutziu-Deicher，HD） 抗體。含Neu5Gc 的生物大分子，如Neu5Gc 糖蛋白、糖脂和多糖都是HD 抗體的特異抗原。癌癥和某些傳染病患者以及感染了一種惡性皰疹病毒名為馬雷克氏?。╩arek’s disease）的雞體內也自發存在HD 抗體。隨著Neu5Gc 在體內參與生物合成而不斷積累，并在癌變的組織中高水平表達，Neu5Gc 被認為是癌細胞的分子標記之一[23]。雖然人體中的唾液酸生物合成酶不能清楚地區分Neu5Ac 和Neu5Gc，但是人體內的體液免疫系統卻能區分[40]，并且所有被測試的人體內都存在Neu5Gc特異性免疫球蛋白（Ig），其水平是變化波動的[25，40]。以唾液酸糖蛋白或神經節苷脂形式整合到細胞表面的Neu5Gc 可被人體產生的Neu5Gc 特異性抗體識別而發生免疫反應和慢性炎癥，稱為異種唾液酸炎（xenosialitis）[40]，從而造成了與Neu5Gc 相關的疾病的發生。雞同人類一樣無法自主合成Neu5Gc，對于外源Neu5Gc 會產生免疫反應[41]。anti-Neu5Gc 抗體還能刺激K 細胞，誘導細胞毒性T 淋巴細胞的細胞殺傷性作用[25]。從這個角度分析，Neu5Gc 的抗體可以誘導腫瘤細胞凋亡，因此Neu5Gc 疫苗能成為腫瘤免疫的新途徑[42]。

2.3 anti-Neu5Gc 抗體促進慢性炎癥及癌癥進程

人體內的anti-Neu5Gc 抗體是多克隆的，復雜的，在個體中可變且具有潛在表位，并且存在于所有健康人體內[43]。由于人體無法合成Neu5Gc，因此，人體獲得Neu5Gc 的唯一途徑是飲食[15]。嬰兒體內從半歲開始出現anti-Neu5Gc 抗體，并在一歲時達到成人水平。這是由于牛奶配方奶粉和含有較多Neu5Gc 的牛肉、豬肉、羊肉等紅色肉類的嬰兒食品中引入了Neu5Gc，從而導致嬰兒體內anti-Neu5Gc 抗體（IgG 與IgG）增加[44]。還有研究顯示，Neu5Gc 攝入量小于8 mg/d 時，Neu5Gc 攝入量越高，anti-Neu5Gc 抗體濃度越大，紅肉及奶制品的過多攝入會致使機體內的anti-Neu5Gc 抗體濃度提高[45]。

整合到人體細胞表面的Neu5Gc 將會引發人體特異性免疫反應（其他食肉哺乳動物無此免疫反應）和慢性炎癥[36]。特異性免疫反應若發生在惡性組織中，不僅能引起慢性炎癥，甚至能進一步促進抗體抗原反應[46]。在人體，紅肉來源的Neu5Gc 被檢測到在動脈粥樣硬化斑覆蓋的內皮細胞層表達[47]。anti-Neu5Gc 抗體結合后可導致內皮細胞的活化，選擇素（selectin）的表達和細胞因子分泌的增加，從而說明紅肉來源的Neu5Gc可以在血管內皮層引發唾液酸炎，加重動脈粥樣硬化和心血管疾病，另外，Neu5Gc 引發的周身性炎癥還能加重二型糖尿病、肌肉萎縮等疾病[36]。除此之外，Neu5Gc 在人類癌癥[31]、動脈粥樣硬化和大腸桿菌志賀氏毒素中的潛在病理作用也受到了重視[45]。這些研究表明，Neu5Gc 在大多數情況下通過與Neu5Gc 特異性Ig 相互作用而積極加劇這些疾病。因此，Neu5Gc 可能是紅肉特異性相關的多種疾病的共同致病機理。

anti-Neu5Gc 抗體可以促進癌癥進程[43]?，F已證明了從正常人血清中純化的anti-Neu5Gc 抗體可以特異性結合到人癌切片上。另外，正常人血清中的anti-Neu5Gc 抗體可以在體外培養的表達Neu5Gc 的人細胞上沉積補體[25]。盡管這種抗體的高水平表達可能造成細胞毒性，但Neu5Gc 和anti-Neu5Gc 抗體聯合產生的弱炎癥反應可能會有助于促進癌變或腫瘤進展[43]。慢性炎癥可以刺激癌癥的發生，約20%的惡性腫瘤來自于炎癥[48]。Varki 實驗室用CMAH 基因敲除小鼠模擬人體試驗證實，飼料中添加的Neu5Gc 可以整合到小鼠體內[49]，當注射或誘導產生Neu5Gc 抗體后，抗體抗原反應引發的炎癥促進肝癌的發生[32]和B16 黑色素瘤細胞的生長[40]。因此，人們通過食用紅肉，積累了外源性Neu5Gc 于體內，從而引發了抗原抗體反應，抗原抗體反應又通過促進慢性炎癥來刺激癌癥的發展，這就是Neu5Gc 特異性致癌的原因。值得注意的是，單獨使用anti-Neu5Gc 抗體或anti-Neu5Gc 的表位抗體與紅肉攝入量、冠心病或結直腸癌（colorectal cancer，CRC）風險無關。然而，當將所有Neu5Gc 糖蛋白的抗體反應合并時，與CRC 風險呈正相關?？侷gG 抗體濃度較高的前四分之一個體的風險幾乎是較低的后四分之一個體的3 倍[50]。

3 展望

大量的流行病學調查報告顯示，紅肉和加工肉制品的食用與直盲腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、動脈粥樣硬化、二型糖尿病、年齡依賴性黃斑病變、類風濕性關節炎等疾病，甚至與人的壽命相關。這是因為紅肉中的Neu5Gc 能引發人體免疫應答產生 anti-Neu5Gc 抗體，從而引起各種疾病及癌癥。在腫瘤細胞中Neu5Gc 的含量明顯比健康細胞中多，降低Neu5Gc的攝取量，不僅可以降低心血管等疾病的風險，而且可以降低腫瘤疾病的惡化。近年來，Neu5Gc 及其抗體在腫瘤檢測和治療方面應用越來越多，一是因為它是大多數內臟腫瘤的特異性標志物，二是因為Neu5Gc 及其產生的相應抗體有成為腫瘤生物治療的潛質，抗Neu5Gc 的抗體能刺激CTL 的細胞殺傷性作用。更深入的研究則需要了解Neu5Gc 分別進入腫瘤細胞和健康細胞中途徑的區別，從而為降低人體對Neu5Gc 的吸收途徑提供參考。