海洋源乳桿菌抑菌物質的研究

孫夢瑩，焦煕棟，李新玲，妥彥峰，*

（1.大連工業大學食品學院，遼寧大連116034；2.新疆天潤乳業股份有限公司，烏魯木齊新疆830000）

防腐劑是一種能防止食品腐敗變質的食品添加劑，主要原理就是抑制食品中微生物的繁殖[1]。乳酸菌是一大類發酵糖產生大量乳酸的兼性厭氧菌，許多乳酸菌除產生乳酸、乙酸和雙乙酰外，還可以產生一些具有抑菌性能的細菌素，這些物質不僅能保持食品的風味還可以抑制食品腐敗菌的生長，在食品防腐保鮮方面起著重要的作用[2-3]。乳桿菌屬細菌是乳酸菌屬中最為重要的菌屬，作為一種安全的益生菌，乳酸菌大量的分布在海洋魚類的腸道中，可以增強動物包括魚在內的機體免疫反應和生長[19]，近年來關于魚腸道乳酸菌的分離以及抑菌物質研究、乳桿菌食品防腐保鮮逐漸成為熱點。

李曉婷等[4]研究發現ALAC-1 和ALAC-4 兩株乳桿菌對黃曲霉具有良好的抑菌作用，其菌株代謝產物中的蛋白類、有機酸等物質可以抑制霉菌的生長；杜琨[5]研究發現添加乳酸菌產生抑菌物質的保鮮劑可提高冷卻豬肉在冷藏過程中的保鮮效果，延長冷卻豬肉的保質期。馬歡歡等[6]研究表明，Lb.plantarumDL3 對黑曲霉的抑制率高達92.28%，發現其對黑曲霉的抑菌作用主要通過破壞黑曲霉孢子的完整性，從而抑制其生長、繁殖。劉佳秀等[22]發現海洋魚類來源的L.plantarumY12 具有抑制魚肉中腐敗菌的生長、防止魚肉腐敗的功能。

本文主要采用牛津杯瓊脂擴散法研究從4種海魚（鲅魚、大黃魚、梭魚和鴉片魚）腸道中分離出的乳桿菌代謝產物對幾種常見的食品腐敗菌的拮抗效果，旨在篩選出拮抗活性較強的乳桿菌菌株，并初步判定出菌株產生的主要抑菌物質屬于哪類物質，能加速人類對海洋源乳酸菌資源的開發和利用，對海洋源乳酸菌將來在乳制品、蔬菜、飼料、肉制品的發酵以及食品的防腐保鮮中的應用都有指導的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海魚：大連市內海鮮商行；試驗所用6種腐敗菌大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（salmonella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes），志賀氏菌（Shigella Castellani）、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）標準菌株：大連工業大學大連市益生菌功能研究重點實驗室保存菌株；MRS 瓊脂、MRS 肉湯、LB 營養肉湯、LB瓊脂培養基、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司；胃蛋白酶：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、乙酸鈉：天津石英鐘廠霸州市化工分廠；30 %過氧化氫、無水葡萄糖、磷酸氫二鉀、MnSO4·4H2O：天津市科密歐化學試劑有限公司；MgSO4·7H2O：天津市瑞金特化學品有限公司。

1.2 主要儀器設備

DNP-9082 型電熱恒溫培養箱、電熱恒溫通風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；5804R 型冷凍離心機：Eppendorf 中國有限公司；AW200SG 型厭氧工作站：英國ELECTROTEK 公司；SX-500 型全自動高壓滅菌鍋：日本Tomy Digital Biology 公司；PL303 型電子分析天平、S210-K 型SevenCompact pH 計：梅特勒-托利多儀器有限公司；V-1100D 型可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；KQ5200DE 型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SL-II 型層析實驗冷柜：寧波新芝生物科技股份有限公司；L320 生物光學顯微鏡：深圳市西派克光學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海魚腸道菌株分離

超凈工作臺內，用70%酒精擦拭海魚魚體表面解剖海魚胃腸道、無菌剪刀剪碎置于無菌研缽中，加入0.85%滅菌的生理鹽水15 mL，研磨3 min，形成勻漿液，吸取1 mL 溶液作為海魚腸道原液。取0.1 mL 原液加入0.9 mL 0.85%的無菌生理鹽水試管中，進行梯度稀釋，吸取100 μL 的稀釋液于MRS 固體培養基上涂布，30°C 厭氧培養48 h，直至形成單個菌落。

挑選菌落形態良好的單菌落置于5%過氧化氫溶液的載玻片中，進行過氧化氫酶試驗[7]。0.5 min 內產生氣泡的為過氧化氫酶陽性細菌、反之為過氧化氫酶陰性細菌。

對過氧化氫酶陰性菌株進行革蘭氏染色，觀察菌株顏色，菌株呈現藍紫色為革蘭氏陽性細菌（G+）、呈現紅色為革蘭氏陰性細菌（G-）[18]。

以過氧化氫酶試驗陰性、革蘭氏染色陽性的菌株進行后續試驗，篩選具有抑菌活性的乳桿菌。

1.3.2 初篩乳桿菌的抑菌試驗

采用牛津杯瓊脂擴散法[8]進行抑菌試驗，牛津杯直徑為8 mm，以抑菌圈的平均直徑±標準誤差來描述菌株抑菌能力的強弱。

取0.1 mL 乳桿菌菌液接種于5 mL MRS 培養液中，37 ℃培養18 h，連續傳代2 次后于4 ℃保存待用。取0.1 mL 大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌屬和金黃色葡萄球菌菌液接種于5 mL LB 肉湯培養基中，0.1 mL 單增李斯特菌接種于5 mL TSA-YE 培養基中，傳兩代后使用。

將活化的乳酸菌發酵液4℃、8000r/min 離心10min，棄沉淀（菌體）保留上清液，并過0.22 μm 濾膜除菌，收集濾液即為乳桿菌上清液，置4 ℃冰箱中保存備用。

以大腸桿菌為指示菌，采用牛津杯瓊脂擴散法研究乳桿菌上清液的抑菌性能，從中初篩選出抑菌活性較強的幾株乳桿菌株。

同樣采用牛津杯瓊脂擴散法研究初篩乳桿菌對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌的抑菌效果。

1.3.3 乳桿菌代謝產物中抑菌物質的確定

1.3.3.1 排除有機酸試驗

選取革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌來作為指示菌，篩選出具有抑菌活性的乳桿菌所產生的抑菌物質。首先排除有機酸的干擾，用1 mol/L 的NaOH 中和菌株上清液中的有機酸，將pH值調至空白MRS 的pH值，并采用牛津杯瓊脂擴散法進行抑菌試驗，1 號孔加入正常的發酵上清液，剩下3 個孔加入中和酸后的上清液。

1.3.3.2 排除過氧化氫試驗

若證明了乳桿菌代謝產物不完全是有機酸在起作用，則需要進行過氧化氫作用的排除試驗，試驗中將離心獲得的乳桿菌發酵上清液在80 ℃水浴鍋中加熱10 min 使過氧化氫充分分解后進行抑菌試驗[9]。試驗中以未經處理的發酵上清液作為對照。

1.3.3.3 蛋白酶敏感性試驗

分別用中性蛋白酶和胃蛋白酶處理發酵上清液[10]。用1 mol/L NaOH 調上清液pH值至中性蛋白酶最適pH 7.0，控制加酶量0.5 mg/mL，37 ℃水浴2 h 后，再用1 mol/L HCl 調pH值至發酵液原pH值進行抑菌試驗，而胃蛋白酶處理的樣品不需要調整pH值。試驗過程中以未經蛋白酶處理的乳桿菌上清液作對照。如果僅為驗證在酸性條件下才起作用的細菌素，則只需要將上清液用胃蛋白酶進行處理。

1.3.4 統計分析

所有試驗均進行了重復試驗，試驗結果采用IBM SPSS 22.0 軟件進行統計分析，比較所得數據之間的顯著差異性（P<0.05）。

2 結果與討論

2.1 海魚腸道菌株的篩選

海魚腸道菌株的鏡檢及過氧化氫酶試驗結果見表1。

由表1可知從黃魚、鴉片魚、鲅魚和梭魚4種海魚腸道中篩選出的41 株菌株全部為革蘭氏陽性菌，其中包括21 株桿菌和20 株球菌，通過過氧化氫酶試驗發現21 株桿菌全部為過氧化氫酶試驗陰性菌，因此初步認定乳桿菌屬細菌，在剩下的20 株球菌中，菌株B2-11 為過氧化氫酶試驗陽性菌株，因此可以排除其為乳酸菌屬細菌的可能，其余的球菌則可能是乳酸球菌屬、鏈球菌屬或腸球菌屬細菌。通過對21 株桿菌菌落形態以及其在顯微鏡下染色后形態的觀察，最終篩選了16株桿菌作為后續的研究菌株，部分桿菌在顯微鏡下的菌體形態見圖1。

表1 海魚腸道菌株的鏡檢及過氧化氫酶試驗結果Table 1 Microscopic examination of intestinal strains of sea fish and results of catalase test

2.2 高抑菌性乳桿菌的篩選乳桿菌發酵液對大腸桿菌的抑菌效果見表2。

由表2可看出，從梭魚腸道中分離得到的菌株S2-6 抑菌作用最為明顯，抑菌圈直徑達到了14.77 mm，而菌株S3-2 拮抗作用較弱，抑菌圈直徑只有8.64 mm，而菌株S2-4，Y3-1，B2-3，B2-4，B2-10 和H2-4 也表現出較強的抑菌效果，其余菌株的抑菌直徑則沒有超過12.50 mm。整個試驗過程均以無細胞發酵上清液來作為抑菌物質，結果表現出了一定程度的抑菌性，表明抑菌物質主要存在于菌株的無細胞代謝產物中，這一結果與茍小蘭等[11]的研究結果相類似，都表明乳酸菌的抑菌物質主要存在于代謝產物中，菌體本身并沒有抑菌作用。從梭魚中選出的S2-4，S2-6，鴉片魚中選出Y3-1，鲅魚中選出B2-4，B2-10 和海魚H2-4 作為抑菌性較強的高抑菌性乳桿菌菌株，進行后續的研究菌株。

圖1 幾株桿菌在顯微鏡下的菌體狀態Fig.1 The bacterial status of several strains of bacteria under the microscope

表2 16株乳桿菌發酵液對大腸桿菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of 16 Lactobacillus fermentation broth on Escherichia coli

2.3 高抑菌性乳桿菌的抑菌試驗

采用同樣的方法研究了篩選出的6株乳桿菌對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌這五種指示菌的拮抗效果。試驗中同樣將指示菌的菌密度控制為OD600=0.4±0.05，結果發現這6株乳桿菌對所有選取的食品腐敗菌都有一定的拮抗作用，抑菌圈直徑大小見表3。

表3 乳桿菌發酵液對拮抗菌株的抑菌效果Table 3 Antibacterial effect of Lactobacillus fermentation broth on antagonistic strains

從表3中可以看出菌株S2-6 和Y3-1 的抑菌效果最好，對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌這五種食品腐敗菌均有較強的抑制效果且抑菌圈直徑都大于14 mm，其中菌株S2-6對沙門氏菌的抑菌圈直徑最大達到了16.45 mm，菌株Y3-1 對志賀氏菌的抑菌圈直徑也達到了16.61 mm。此外菌株B2-4 對沙門氏菌，志賀氏菌和副溶血性弧菌3種革蘭氏陰性菌抑菌效果較好，抑菌圈直徑分別達到15.32、15.61、15.52 mm，對另外兩株革蘭氏陽性菌株的抑菌圈直徑則在13.00 mm 左右，因此菌株B2-4 對革蘭氏陰性菌的抑菌性能可能要強于革蘭氏陽性菌。雖然每株桿菌產生的抑菌物質可能相同，對不同的指示菌，6株乳桿菌會表現出不同的抑制效果，6株乳桿菌都對沙門氏菌和副溶血性弧菌有較強的抑菌效果，其抑菌圈直徑都較其它食品腐敗指示菌大，平均直徑都在15.00 mm 左右。但是菌株S2-4 對志賀氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用卻不是很明顯，抑菌圈直徑只有9.91 mm 和8.35 mm，都沒有超過10 mm。

2.4 乳桿菌代謝產物抑菌物質的研究

2.4.1 排除有機酸試驗

乳桿菌在代謝過程中可產生有機酸，有機酸可能是抑菌的主要物質，試驗中將6株桿菌傳代培養并離心獲得上清后，測得其上清液pH值均在3.5～4.0 之間，之后用1 mol/L 的NaOH 中和上清液代謝產物中的有機酸，將pH值調至空白MRS 的pH值，同時用未調pH值的上清液作為對照，進行抑菌試驗，如表4。

表4 排除有機酸試驗的抑菌效果Table 4 Eliminate the antibacterial effect of organic acid test

表4表明，所有經過中和有機酸后的試驗組，無論對大腸桿菌還是金黃色葡萄球菌均未產生明顯的抑菌圈，而未經中和的上清液均顯示出抑菌圈。這說明乳桿菌發酵上清液中可能是代謝產生的有機酸在充當抑菌物質，Vazquez 等研究9 株不同來源的乳酸菌對致病菌有抑制作用，認為乳酸菌主要通過分泌乳酸、乙酸等有機酸來抑制病原菌的生長[21]。上清液中還可能存在一些特殊細菌素，它們只在酸性條件下發揮抑菌作用，因而未能在上述試驗條件下表現出抑菌效果，所以要用能在酸性條件下發揮作用的胃蛋白酶處理上清液以驗證是否有細菌素的存在。

2.4.2 蛋白酶敏感性試驗

試驗過程中通過對乳桿菌發酵上清液進行蛋白酶處理，來驗證上清液抑菌物質中是否含有蛋白類細菌素。排除有機酸試驗已經說明本試驗只需要使用胃蛋白酶對發酵上清液進行酶解，檢測酶處理后的上清液是否還有抑菌能力，蛋白酶敏感性試驗結果見表5。

表5 排除乳桿菌發酵液中蛋白后的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of removing protein from Lactobacillus fermentation broth

由表5可以看出菌株S2-6、Y3-1 和B2-10 經胃蛋白酶處理后的發酵上清液對大腸桿菌的抑菌圈顯著變小（P<0.05），對金黃色葡萄球菌抑菌效果不明顯，而菌株S2-4 在處理前后對兩種致病菌的抑菌效果均不明顯；經蛋白酶處理后的菌株H2-4 對兩種致病菌均有顯著的抑菌效果（P<0.05），推測H2-4 可能為一種產廣譜蛋白類抑菌物質的乳酸菌株，其抑菌結果如圖2.5所示。雖然初步判定出了這幾株桿菌產生抑菌物質，但是菌株產生的蛋白類抑菌物質需要進一步的分離純化，其結構及理化性質也有待于進一步深入的研究，以方便人們對海洋源乳酸菌蛋白類抑菌物質的開發和利用，推動細菌素在食品保鮮方面的應用。

2.5 乳桿菌菌株的鑒定

本試驗所分離的乳桿菌株均委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行細菌的16S rDNA 序列測定。6株菌株的相似性及NCBI 登錄號如表6所示。

表6 6株乳桿菌株的NCBI 參考結果Table 6 NCBI reference results of 6 strains of Lactobacillus

由表6可知，菌株B2-4、H2-4、S2-4 被鑒定為米酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），菌株S2-6 和Y3-1 被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。但是從鲅魚腸道分離的B2-10 卻被鑒定為灰黃色腸球菌（Enterococcus gilvus）或 病 臭 腸 球 菌（Enterococcus malodoratus），這兩株菌都屬于同種的鳥腸球菌群。

現篩選的菌株B2-10 被鑒定為腸球菌屬（Enterococcus）細菌，該屬細菌也是革蘭氏陽性、無芽孢的過氧化氫酶試驗陰性菌，但是腸球菌不屬于本試驗旨在篩選的乳桿菌屬細菌，造成這一結果的主要原因是由于腸球菌屬細菌多為圓形或橢圓形，成對或短鏈狀排列，并且一些細菌可能處于分裂狀態，其形態易與短桿菌相混淆，以致鏡檢時將其誤認為是乳桿菌屬細菌，現將其糾正為腸球菌屬細菌。

周偉等[12]發現植物乳桿菌素L-1 能抑制單增李斯特菌的生長，不過近幾年發現一些植物乳桿菌素也能抑制革蘭氏陰性菌的生長。這和本試驗發現的S2-6 和Y3-1 兩株植物乳桿菌對革蘭氏陰性菌大腸桿菌有抑制作用結果相一致，洪偉等[13]也曾從腌菜中分離出一株能拮抗大腸桿菌的植物乳桿菌，董雪鳳等[20]也認為乳酸菌對大腸桿菌有明顯的抑制作用，其抑制作用的強弱與乳酸菌活力和大腸桿菌的濃度有關，這些結果為今后深入的研究和利用植物乳桿菌素奠定了一定的基礎。此外本試驗還從鲅魚、黃魚和梭魚腸道中各分離出了一株米酒乳桿菌，編號依次為B2-4、H2-4 和S2-4。米酒乳桿菌主要分布在酸泡菜[14]、發酵面團、發酵香腸[15]等發酵食品中，本試驗從海魚腸道中分離出米酒乳桿菌實在為少見。但是關于米酒乳桿菌素C2 的研究卻很多[12，16]，劉曉燕等[17]研究發現米酒乳桿菌素C2除了具有很好的穩定性外，還能對金黃色葡萄球菌起到抑制作用，這與本試驗分離得到米酒乳桿菌B2-4 性質極為相似。

3 結論

本試驗從梭魚和鴉片魚腸道中各分離出一株植物乳桿菌S2-6 和Y3-1，能夠在代謝中產生蛋白類抑菌物質，可抑制大腸桿菌的生長；從海魚中獲得的米酒乳桿菌H2-4 產生的細菌素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均產生抑制效果，因此推測其可能是一株產廣譜細菌素的米酒乳桿菌，而這些細菌素也需要于進一步深入的研究和純化。從海魚中分離具有廣譜抑菌性能的乳酸菌，可作為潛在的生物保鮮劑應用于海洋魚類的保鮮。