高氧氣調包裝抑制菜心木質化關鍵酶苯丙氨酸酶的研究

羅政，郭媛媛，陳飛平，宮曉波，陳于隴

（廣東省農業科學研究院蠶業與農產品加工研究所，廣東廣州510610）

菜心（Brassica parachinensis）是廣東地區主要栽培的特色蔬菜之一，其營養豐富，質嫩味佳，風味可口[1]。但是菜心采摘后，菜心的木質化嚴重影響菜心品質和口感。木質素的生物合成需要一系列酶類地催化，其單體合成由苯丙氨酸開始，通過氧化和聚合反應將這些結構單元直接羥化聚合為木質素[2]。而苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）是苯丙烷類代謝途徑的第一步反應的限速酶和關鍵酶[3-6]，在植物木質素代謝過程中起著重要作用。當今，國內外針對高氧氣調對蔬菜中酶活的影響的研究逐漸增加。王貴禧等[7]在研究中發現采用100%O2處理后的冬棗中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性要低于采用70%O2處理后的冬棗，說明高氧可以有效的減緩冬棗貨架期的衰老。鄭永華等[8]用90%O2處理枇杷，可有效抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性，降低果肉褐變程度及木質素的生物合成。Day[9]也指出高氧能夠抑制PPO 的活性。高氧氣調包裝對鮮切菜心木質化PAL 的研究鮮有報道，研究大多集中在PAL 在植物抗病反應過程中的作用。本試驗采用高氧氣調包裝和空氣包裝鮮切菜心在25 ℃條件下貯藏，研究其木質化程度與調控關鍵酶PAL 活性及其基因轉錄表達間的關系，為高氧氣調包裝處理抑制菜心木質化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜心：廣州市天河區粵墾農貿市場。

TRIzol 試劑盒、第一鏈cDNA 合成試劑盒（TaKaRa PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉錄試劑盒）、2×Taq PCR MasterMix PCR 反應試劑盒、PCR引物：天根生化科技（北京）有限公司；

氯仿、異丙醇、75%乙醇、氯化鋇（均為分析純）：天津市富于精細化工有限公司；DEPC 水：焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）（98 %）；1×TAE 緩沖液：三羥甲基氨基甲烷（Tris base）、乙酸（acetic acid）；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（≥99.9%titration）；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）（分子量：55 000 Da）；20 mmol/L L-苯丙氨酸BR（99%）：上海源葉生物科技有限公司；Biowest瓊脂糖：廣東環凱微生物科技有限公司；液氮：佛山市禪城區普雷克絲氣體配套設備貿易部；72%的濃硫酸（分析純）：珠海市化成達化工有限公司；0.1 mol/L pH 8.8 硼酸緩沖液（分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

S1000 型快速PCR 儀、164-5050 型核酸電泳儀及電泳槽、ChemiDocTMXRS 凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；MAP-1D400 型盒式氣調包裝機：上海炬鋼機械制造有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型予華牌循環水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；UV1800 型紫外可見分光光度計：日本島津公司；CARY Eclipse 熒光分光光度計：美國VARIAN 公司；Sorvall Stratos 冷凍高速離心機：美國ThermoFisher 公司；

1.3 試驗方法

1.3.1 材料的預處理

將新鮮菜心整理、分級、洗凈，甩干表面水分后，選取新鮮未木質化、長度均勻（約18 cm）且無機械損傷的新鮮菜心400 g 為一袋進行包裝，5 組用高氧氣調包裝，其中O2濃度固定比例大于90%，CO2濃度低于1%，其它N2補充。另外5 組空氣包裝（記作CK）。包裝袋材質為PE，每個包裝中注入氣體總體積約為200 mL。試驗時樣品用液氮研磨成粉末置于-20 ℃貯藏待用。還有一組作為0 d 對照處理，貯藏于25 ℃，以上分別設置3 個重復，每隔1 d 取樣一次，共取樣5 次。

1.3.2 ribonucleic acid（RNA）的提取及檢測

采用TRIzol 試劑盒的方法加以改進。取0.5 g 用液氮研磨好的菜心于離心管中，加入1.0 mL Trizol 試劑，將研磨液充分搖勻，室溫靜置10 min 后，在12 000 r/min 4 ℃離心5 min；去除沉淀后加入0.2 mL 氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 s；室溫靜置15 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min；吸取上清液置于一新的離心管中，加入0.5 mL 預冷的異丙醇，混勻后于室溫靜置5 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液，RNA 沉淀用1 mL 75%乙醇溶液洗，8 000 r/min 4 ℃離心5 min；棄去上清液，加入DEPC 水充分溶解。提取的RNA 濃度及純度由分光光度計測定其OD值。

1.3.3 逆轉錄合成第一鏈complementary deoxyribonucleic acid（cDNA）

參照TaKaRa PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉錄試劑盒說明書進行。反應條件為：65 ℃保溫5 min 后冰上迅速冷卻（目的使模板RNA 變性，提高反轉錄效率），之后加入逆轉錄酶，30 ℃保溫10 min 后再95 ℃保溫5 min（使酶失活），拿出后在冰上迅速冷卻。

1.3.4 PCR 擴增反應

以逆轉錄得到的cDNA 為反應模板，參照2×Taq PCR MasterMix PCR 反應試劑盒說明書進行PCR 擴增反應。按下列體系加樣：2 μL 模板cDNA，上游引物1 μL，下游引物1 μL，12.5 μL 的2×MasterMix，最后用ddH2O 補足至25 μL。PCR 反應循環的設置如下：94 ℃3 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環；72 ℃5 min。

1.3.5 PCR 反應產物的檢測

反應結束后取1 μL 6×LoadingBuffer 和5 μL產物均勻混合，加入含1 μL DNAGreen 的3.0%瓊脂糖凝膠中，150 V 電泳45 min。電泳結果用Bio-Rad 公司的凝膠成像系統進行紫外成像和光密度掃描分析。

1.3.6 苯丙氨酸解氨酶（PAL）的測定

參考Koukol 等[10]的方法測定并加以改進。稱取3 g 用液氮研磨過的鮮樣，之后加pH 8.8，0.05 mol/L 硼酸緩沖液（內含5 mmol/L 巰基乙醇）7 mL 及PVP 0.4 g，冰浴研磨，研缽應該提前預冷，將研磨充分的樣液在4 ℃下12 000 r/min 離心20 min，取上清液用于酶活性測定。反應液系統包括：0.1 mL 酶液，1.9 mL 0.1 mol/L pH 8.8 的硼酸緩沖液和1 mL 20 mmol/L 苯丙氨酸溶液，反應液在37 ℃水浴中保溫1 h 后，立即加入0.1 mL 1%HCl 溶液終止反應，測定保溫前后酶液在290 nm 下的OD 值，以每小時在290 nm 處吸值收變化0.01 所需酶量為一個酶活力單位。測定3 次重復。

1.3.7 木質素測定

參考Kirk，T.K.等[11]方法并加以改進。稱取5 g 用液氮磨碎的菜心，移入100 mL 燒杯中，加入30 mL 質量分數為72%的濃硫酸，充分攪拌混勻后，在35 ℃恒溫水浴1 h，之后用蒸餾水潤洗，將洗滌液移入1 000 mL燒杯中，將體積定容到700 mL。將該稀酸液煮沸2 h，這個過程要保持液體體積不變。待其冷卻后，用烘干過的恒重G4 砂芯漏斗抽吸過濾，洗滌至洗液與10 %BaCl2溶液反應無白色沉淀為止，于80 ℃烘干至恒重稱量，測定3 次重復。

式中：ω 為木質素含量，%；m0為樣品質量，g，m1為砂芯漏斗凈重，g；m2為干燥后砂芯漏斗質量，g。

1.3.8 數據處理

每個試驗重復3 次，其結果表示為平均值。利用Origin，9.0 生成圖表分析木質素含量及酶活力變化的趨勢。電泳結果采用專業軟件Quantity One V4.5 處理。

2 結果與分析

2.1 高氧氣調包裝對木質素含量的影響

鮮切菜心在25 ℃下，5 d 內木質素含量的變化規律如圖1所示。

圖1 鮮切菜心在25 ℃下木質素含量的變化規律Fig.1 Thechangesoflignincontentoffresh-cutcabbageunder25 ℃

在植物體中，木質素含量在15%～36%之間，是地球上僅次于纖維素的大分子有機物[12]，是構成細胞壁次生結構的主要成分，有硬化細胞壁的作用，但果蔬中過高的木質素含量會影響其食用品質[13]。陳學紅等[14]對綠蘆筍采用了80%濃度的高氧包裝處理，貯藏期間PAL 和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性均受到抑制，木質素的合成量與空氣處理相比顯著降低。

本試驗中采用氧濃度90%以上的高氧處理，由圖1可知，鮮切菜心木質素含量隨貯藏時間逐漸增加，并且隨貯藏期的延長增加速度變緩。且處理組的木質素含量均低于對照組，到第3 天時，兩種處理下的木質素含量接近。總體增長速度處理組要低于對照組，說明高氧氣調包裝可延緩鮮切菜心木質素含量的增加。

2.2 高氧氣調包裝對苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

鮮切菜心在25 ℃下，5 d 內PAL 活性的變化規律如圖2所示。

圖2 鮮切菜心在25 ℃下PAL 活性的變化規律Fig.2 TheChangeofPALactivityoffresh-cutcabbageunder25 ℃

PAL 是木質素合成途徑的第一個酶，其酶活性能夠直接影響植物的木質素合成，在多種植物中發現在木質化組織中含有較高的PAL 活性，而在這些植物的非木質化組織中不能檢測到PAL 活性[15]。PAL 酶基因的轉錄表達極易受到外界各種刺激因子的誘導[16]。如，光、溫度、機械傷害、病原微生物侵染、外源植物激素和氣體成分等均對PAL 基因在轉錄水平有誘導作用[17-20]。

高氧氣調抑制酶活的機理主要是通過抑制呼吸從而降低果蔬木質素合成的相關酶活達到的。在貯藏過程中，高氧氣調包裝的鮮切菜心的PAL 活要低于對照組。Tucker 和Laties[21]認為氧氣濃度超過呼吸鏈末端氧化酶的飽和濃度時，其對呼吸有負反饋抑制作用。Limbo 等[22]用高氧氣調包裝處理馬鈴薯，發現其貯藏期間揮發性物質的顯著減少，呼吸作用受到抑制。

陳學紅等[23]對鮮切萵苣進行高氧處理也得到了同樣的結果，在貯藏一定時間后，呼吸作用會達到高峰同時PAL 活也會達到高峰，后持續降低。貯藏期間對照組的PAL 活性要低于對照組，因此高氧處理對PAL 活有抑制作用。

在An Jianshen 等[24]研究采用高濃度臭氧對蘆筍進行處理，發現其PAL 活性受到明顯抑制，而且抑制作用與臭氧濃度正相關，這說明高濃度的氧處理對果蔬產品PAL 活性有抑制作用。

2.3 高氧氣調包裝對木質素PAL 在轉錄水平表達的影響

鮮切菜心在25 ℃下，5 d 內PAL 的DNA 轉錄水平表達如圖3所示。

圖3 鮮切菜心在25 ℃下PAL 基因的表達差異Fig.3 The difference of PAL enzyme gene expression of fresh-cut cabbage under 25 ℃

由圖中可得知，每個樣品的PAL 的基因都發生轉錄水平的表達。結果顯示，從0 d 到第2 天條帶亮度在逐漸減弱，到了第3 天條帶又變亮，之后又逐漸減弱；說明0 d 與3 d 的酶基因表達較多，與之前測定的PAL活性結果一致，在第3 天時出現了PAL 活性高峰。貯藏到第4 天時，可以發現，處理組條帶的的亮度比對照的要弱。

試驗結果表明，PAL 基因在高氧氣調和空氣包裝兩種不同處理方式下均有表達，前期差異不明顯，到后期空氣包裝處理后的PAL 基因的轉錄表達水平高于采用高氧氣調處理，高氧氣調包裝在一定程度上降低了PAL 基因的轉錄表達。孫涵等[25]采用高氧動態氣調處理雙孢蘑菇后，發現除了PAL，高氧氣調還能有效抑制4-香豆酸-輔酶A 連接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL）和肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD），3 種酶活都在貯藏過程中呈現先上升后下降的趨勢，同時其活性與木質素含量呈顯著正相關。而4CL 與CAD 的相關性要大于PAL。

因此，在研究木質素合成的苯丙烷代謝途徑時，還要考慮PAL 以外有很多酶的參和作用，包括：甲基化酶[包括咖啡酸-3-O-甲基轉移酶（caffeic acid-3-Omethyltransferase，COMT）和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶（caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT）]，羥基化酶[香豆酸-3 羥-基化酶（coumarate 3-hydroxylase，C3H 和阿魏酸-5-羥基化酶，Ferulate-5-hydroxylase，F5H）]，連接酶（4CL），還原酶[肉桂酰輔酶A 還原酶，（cinnamoyl-coA reductase，CCR）和CAD]以及聚合酶，Ran 等[26]在對甘藍型黃黑籽油菜種皮發育過程木質素含量變化研究中發現，4CL、F5H 和CAD 酶活力與木質素的含量在前期呈顯著或極顯著關系。所以，通過研究高氧氣調包裝對其他關鍵酶活性的抑制作用，能更有效的提高保鮮效果，減少蔬菜木質化。

3 結論

采后果蔬硬度增加主要是由于組織纖維化，甚至逐步產生木質素的積累，導致組織發生木質化，木質化后的葉菜細胞壁變厚，皮質變韌，口感也會嚴重下降。

本試驗中，鮮切菜心在高氧包裝下，其木質素增長速度隨貯藏期的延長增加速度變緩，但普通包裝下，鮮切菜心木質素合成速度在3 d 后會再次加快；同時PAL 活性及轉錄水平表達均在3 d 時達到高峰，后持續降低，其中3 d 后空氣包裝處理的PAL 基因的轉錄表達水平高于高氧氣調處理；因此認為抑制PAL 的活性及其基因的轉錄表達與鮮切菜心木質素的合成速度變緩是相關的。結合前人的研究，朱海英等[27]研究絲瓜發育過程的木質素的積累趨勢，發現PAL 和CAD 的活性高峰出現在木質素大量合成之前。吳曉麗等[28]研究發現竹筍在貯藏過程中木質素含量增加與PAL、POD 活性呈正相關，說明竹筍的采后老化和木質化是PAL、POD 活性增高引起的。吳錦程等[29]研究得出枇杷果實的木質素合成與PAL 活性之間具有較高的相關性，PAL 活性差異是導致不同成熟度冷藏枇杷果實產生不同程度木質化的主要因素。

本試驗采用高氧包裝處理，通過抑制鮮切菜心的呼吸作用，進而抑制了鮮切菜心在貯藏過程中的PAL基因的轉錄表達及其活性。結合前人研究，周濤等[30]經研究通過氣調包裝抑制了輕加工茭白中PAL 和POD酶的活性，進而抑制了其木質素的合成，延緩了茭白的老化速率。李偉麗等[31]利用80%高氧處理雪蓮果，吳緒敏等[32]利用高氧氣調包裝鮮切洋蔥，均能有效抑制相關酶活性。

本試驗結果認為，高氧氣調包裝可以在一定程度上抑制鮮切菜心PAL 基因的轉錄表達及其活性，從而降低其木質素含量，減緩鮮切菜心木質化進程，從而延長其貨架期。