產(chǎn)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)山藥護(hù)色及多糖免疫活性的影響

曾麗萍，田文妮，夏雨，黎攀，杜冰，*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642；2.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東中山528437）

山藥，薯蕷科，又稱薯蕷、白山藥等。山藥富含多種營(yíng)養(yǎng)及功能活性物質(zhì)，如多糖、尿囊素等。山藥多糖是山藥中的主要活性成分，具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤等作用[1-2]。但由于山藥水分含量高，難以長(zhǎng)時(shí)間保存，因此往往需要對(duì)山藥進(jìn)行干制處理，能夠有效延長(zhǎng)山藥的貯藏期[3-4]。山藥在加工中極易產(chǎn)生褐變，影響其品質(zhì)。目前常用于山藥護(hù)色的褐變抑制劑主要是含硫護(hù)色劑，其中亞硫酸鹽不僅能夠有效抑制酶促反應(yīng)，還能抑制非酶褐變，從而延緩或者抑制褐變的發(fā)生，因此尤其受到廣泛的應(yīng)用。盡管采用含硫護(hù)色劑能夠取得很好的護(hù)色效果，但是產(chǎn)品中可能存在的殘硫量超標(biāo)的問(wèn)題，嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)，還可能帶來(lái)食品安全問(wèn)題[5]。因此，選用合適的非硫護(hù)色劑能夠有效保障山藥加工的品質(zhì)。

現(xiàn)有研究表明，加工過(guò)程中不同的處理手段可能影響山藥多糖的得率和山藥多糖的活性[6]，但目前多集中與研究提取方式對(duì)于山藥多糖的影響。護(hù)色方式對(duì)于山藥多糖的影響上未見(jiàn)報(bào)道。因此找尋合適的非硫護(hù)色劑對(duì)山藥進(jìn)行護(hù)色，并探究其對(duì)山藥多糖的含量和活性的影響尤其重要。本研究采用產(chǎn)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液為原料，制備新型護(hù)色劑對(duì)山藥多糖進(jìn)行護(hù)色，并探究其與傳統(tǒng)含硫護(hù)色對(duì)山藥多糖活性的影響，為山藥的護(hù)色工藝的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥：河南焦作；產(chǎn)乳酸芽孢桿菌DU-106 篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪，現(xiàn)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品與功能性原料評(píng)價(jià)及研究中心鑒定及保藏；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：sigma 試 劑 公 司；DMEM （dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco 公司；無(wú)水乙醇：廣州化學(xué)試劑廠；CCK-8 試劑盒：日本同仁化學(xué)研究所；細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）試劑盒：欣博盛生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市華普達(dá)數(shù)學(xué)儀器有限公司；ANKE TDL-5-A 離心機(jī)：上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司；752-N 紫外分光光度計(jì)：上海精密儀器有限公司；Labserv K3 酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；DHP-600 電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；FA2004A 分析天平：上海精天電子儀器廠；HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市富華儀器有限公司；WYT 手持糖量計(jì)：早州中友光學(xué)儀器有限公司；VD-650 桌上式潔凈式工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

挑選大小一致、無(wú)創(chuàng)傷、無(wú)病蟲斑的塊莖，用清水洗凈、淋干，迅速切成2 mm 左右厚的薄片，分別用不同的護(hù)色液處理一定時(shí)間后，置于70 ℃烘箱中烘干至恒重，得干山藥片備用。

1.3.2 發(fā)酵護(hù)色液的制備

1.3.2.1 產(chǎn)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液制備

分別稱取乳清粉20 g、葡糖糖10 g、硫酸鎂1 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸錳0.5 g 溶解于一定量的水中，定容至1 L，分裝滅菌，得發(fā)酵培養(yǎng)基。

將產(chǎn)乳酸芽孢桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為0.1%，置于180 r/min，37 ℃搖床中液體發(fā)酵一定時(shí)間后取出，取出后采用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，得產(chǎn)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液。

1.3.2.2 混合

將1.3.2.1 所得的產(chǎn)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液按照一定要求加水混合均勻，得發(fā)酵護(hù)色液。

1.3.3 護(hù)色工藝單因素

按照1.3.2 的方法分別考察發(fā)酵液發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵液添加量、護(hù)色時(shí)間3 個(gè)因素對(duì)山藥的相對(duì)褐變度和多糖含量的影響。當(dāng)探究發(fā)酵時(shí)間變化對(duì)相對(duì)褐變度和多糖含量影響時(shí)，發(fā)酵液添加量為10%，護(hù)色時(shí)間為1 h；探究發(fā)酵液添加量的影響時(shí)，發(fā)酵液發(fā)酵時(shí)間均為36 h，護(hù)色時(shí)間1 h；探究護(hù)色時(shí)間的影響時(shí)，發(fā)酵液發(fā)酵時(shí)間為36 h，發(fā)酵液添加量為10%。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)護(hù)色工藝進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[7]，選取發(fā)酵液發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵液添加量（B）、護(hù)色時(shí)間（C）3 個(gè)因素為自變量，以多糖得率（Y1）和相對(duì)褐變度（Y2）為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析，得到最佳護(hù)色工藝。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.3.5 山藥多糖的提取

將干山藥片經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)20 目，精密稱取適量處理后的干山藥片，按料液比1∶60（g/mL），沸水浸提2 h 兩次，抽濾合并濾液，用3 倍體積的95%乙醇，醇沉過(guò)夜，沉淀物用75%乙醇洗滌兩遍后，用50 mL水把沉淀物洗入回流瓶中，加入25%鹽酸15 mL，沸水回流水解2.5 h，水解液定容至100 mL，取1 mL 測(cè)定多糖含量。

1.3.6 多糖含量測(cè)定

采用苯酚硫酸法測(cè)定山藥多糖含量[8-9]。

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以葡萄糖當(dāng)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作回歸曲線，線性回歸方程為：y=9.865 6x+0.012 3，R2=0.999。

1.3.7 相對(duì)褐變度測(cè)定

褐變度測(cè)定方法參考劉麗芳[10]，采用相對(duì)褐變度[11]來(lái)表述山藥的褐變程度。相對(duì)褐變度按下式計(jì)算：

式中：A護(hù)色為經(jīng)護(hù)色液處理后的樣品按照褐變度測(cè)定方法處理后在420 nm 下的吸光度值；A空白為經(jīng)清水處理后的樣品按照褐變度測(cè)定方法處理后在420 nm下的吸光度值。

1.3.8 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性測(cè)定

將山藥塊莖用清水洗凈、淋干后迅速切成2 mm左右薄片，分別用A：對(duì)照組（蒸餾水）；B：0.1%亞硫酸鈉（含硫?qū)φ眨籆：發(fā)酵護(hù)色液（經(jīng)由響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化所得最佳工藝）浸泡護(hù)色1 h，參照趙喜亭等[12]的方法提取粗酶液并測(cè)定PPO 和POD 酶活。

1.3.9 山藥多糖免疫活性試驗(yàn)

1.3.9.1 RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)與模型的建立

參考chen 等[13]的方法培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞，略有調(diào)整。其中調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105個(gè)/mL 在96 孔板毎孔加入100 μL 的細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)24 h 后，然后按不同組別將入100 μL 的梯度濃度（2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25 μg/mL）的山藥多糖培養(yǎng)液孵育24 h，分別為空白對(duì)照組：含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)組：含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的經(jīng)由不同護(hù)色處理的山藥中提取的粗多糖。其中，清水處理山藥多糖組（CYH）：加入從清水浸泡處理的山藥中提取的粗多糖；亞硫酸鈉處理山藥多糖組（CYN）：加入經(jīng)亞硫酸鈉護(hù)色處理的山藥中提取的粗多糖；發(fā)酵液處理山藥多糖組（CYF）：加入發(fā)酵護(hù)色液護(hù)色處理的山藥中提取的粗多糖。實(shí)驗(yàn)組加入的山藥多糖均直接溶解于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基后，過(guò)0.22 μm 的無(wú)菌濾膜并重復(fù)3 次。

1.3.9.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

參照chen 等[14]的方法，采用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，其中細(xì)胞增殖率按下式計(jì)算：

式中：OD實(shí)驗(yàn)組為實(shí)驗(yàn)組在450 nm 波長(zhǎng)下的OD值；OD空白對(duì)照組為空白對(duì)照組在450 nm 下的OD值。

1.3.9.3 細(xì)胞因子分泌水平測(cè)定

根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、細(xì)胞白介素（interleukin，IL）-1β、細(xì)胞白介素（interleukin，IL）-6的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵液發(fā)酵時(shí)間對(duì)山藥褐變及多糖含量的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)山藥褐變及多糖含量的影響如圖1所示。

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，山藥多糖的含量呈現(xiàn)先上升后下降，而山藥的相對(duì)褐變度呈現(xiàn)先下降后上升。其中當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為36 h，多糖含量最高為12.22%，此時(shí)山藥的相對(duì)褐變度為51.43%。而在48 h時(shí)，相對(duì)褐變度則達(dá)到最低點(diǎn)為43.81%，此時(shí)山藥多糖的含量為11.01%。綜合考慮，選定36 h 為最佳發(fā)酵液發(fā)酵時(shí)間。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)山藥褐變及多糖含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on polysaccharide yield and browning index

2.1.2 發(fā)酵液添加量對(duì)山藥褐變度及多糖含量的影響發(fā)酵液添加量對(duì)山藥褐變及多糖含量的影響如圖2所示。

圖2 發(fā)酵液添加量對(duì)山藥褐變及多糖含量的影響Fig.2 Effect of the additive amount of color-protective agent on polysaccharide yield and browning index

由圖2可知，隨著發(fā)酵液添加量的增加，山藥多糖得率增加，當(dāng)發(fā)酵液添加量為10%后，多糖含量無(wú)明顯變化。而山藥的相對(duì)褐變度則隨著發(fā)酵液添加量增加不斷下降，直至發(fā)酵液添加量為10%后，再增加發(fā)酵液的添加量，山藥的相對(duì)褐變度無(wú)顯著變化。當(dāng)發(fā)酵液添加量為10%時(shí)，山藥多糖的得率為10.63%，而相對(duì)褐變度為46.95%。綜合考慮，選定最佳發(fā)酵液添加量為10%。

產(chǎn)乳酸芽孢桿菌的主要發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸，發(fā)酵液的添加量不同，護(hù)色液的酸度等均發(fā)生變化。因此，發(fā)酵液的添加量對(duì)山藥多糖的得率和相對(duì)褐變度均有影響，在一定范圍內(nèi)，多糖得率和護(hù)色效果均隨著發(fā)酵液添加量的增加而增加。這可能是因?yàn)樗嵝匀芤耗軌蚪档投喾友趸傅幕钚裕瑫r(shí)也能夠減少氧氣在酸溶液中的溶解度，能夠有效減緩酶促褐變，達(dá)到護(hù)色的效果[15]。同時(shí)，王宗軍[16]認(rèn)為，多糖結(jié)構(gòu)中均含有不穩(wěn)定的“H”，可能自身易被氧化，造成多糖的損失，而劉靜等[17]的研究表明護(hù)色劑在一定程度上能夠起到排氧的作用，能夠抑制多糖被氧化，在一定程度上，發(fā)酵液添加量越大，說(shuō)明其中包含的產(chǎn)乳酸芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物越多，排氧程度越高，因此多糖得率越多。但是當(dāng)發(fā)酵液添加量增大10%，再增大發(fā)酵液添加量對(duì)山藥護(hù)色及對(duì)多糖含量的影響不顯著。

2.1.3 護(hù)色時(shí)間對(duì)山藥褐變度及多糖含量的影響

以添加10%的發(fā)酵時(shí)間為36 h 的發(fā)酵液制備得到護(hù)色液為護(hù)色劑，探究不同護(hù)色時(shí)間對(duì)山藥多糖的得率與山藥相對(duì)褐變度的影響如圖3所示。

圖3 護(hù)色時(shí)間對(duì)山藥褐變及多糖含量的影響Fig.3 Effect of soaking time on polysaccharide yield and browning index

由圖3可知，隨著護(hù)色時(shí)間的延長(zhǎng)，山藥多糖得率先增加后減少，其中護(hù)色時(shí)間為1 h 時(shí)，山藥多糖的得率最高，但當(dāng)護(hù)色時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，其多糖含量變化不明顯。而山藥相對(duì)褐變度則隨著護(hù)色時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升，當(dāng)護(hù)色時(shí)間為1 h 時(shí)，山藥的相對(duì)褐變度最低，其后延長(zhǎng)護(hù)色試驗(yàn)，山藥的相對(duì)褐變度變化不明顯。綜合考慮，選定1 h 為最佳護(hù)色時(shí)間。

2.2 發(fā)酵護(hù)色液制備工藝條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用響應(yīng)面分析法對(duì)發(fā)酵護(hù)色液制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化選取了不同的水平進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，其中發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵液添加量和護(hù)色時(shí)間為自變量，多糖得率和相對(duì)褐變度均為響應(yīng)值，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，多糖得率回歸模型方差分析見(jiàn)表3，相對(duì)褐變度回歸模型方差分析見(jiàn)表4。

運(yùn)用Design Expert8.0 軟件對(duì)表中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行整理分析，回歸擬合，得到的回歸方程預(yù)測(cè)模型如下：

從表3可以看出，一次項(xiàng)中A（發(fā)酵時(shí)間）和B（發(fā)酵液添加量）對(duì)多糖得率的線性效應(yīng)顯著（P＜0.05），C（護(hù)色時(shí)間）對(duì)多糖得率的線性效應(yīng)不顯著（P＞0.05），二次項(xiàng)中，B2、C2影響均極顯著（P＜0.01），AC影響顯著（P＜0.05），AB、BC、A2影響不顯著（P＞0.05）。此模型顯著性檢測(cè)P值小于0.000 1，極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.349 4，不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)為0.980 5，調(diào)整復(fù)相關(guān)指數(shù)為0.955 5。因此，說(shuō)明模型的擬合程度好，試驗(yàn)誤差小。根據(jù)F 值大小可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)多糖得率的影響因素大小依次為A（發(fā)酵時(shí)間）＞B（發(fā)酵液添加量）＞C（護(hù)色時(shí)間）。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design with experimental values of polysaccharide yied and browning index for response surface analysis

從表4可以看出，一次項(xiàng)中C（護(hù)色時(shí)間）對(duì)相對(duì)褐變度的線性效應(yīng)極顯著（P＜0.01），A（發(fā)酵時(shí)間）和B（發(fā)酵液添加量）對(duì)相對(duì)褐變度的線性效應(yīng)顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)中，B2、C2、BC影響均極顯著（P＜0.01），A2影響顯著（P＜0.05），AB、AC影響不顯著（P＞0.05）。此模型顯著性檢測(cè)P值小于0.000 1，極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.053 9，不顯著。模型的相關(guān)系數(shù)為0.990 1，調(diào)整復(fù)相關(guān)指數(shù)為0.979 5。因此，說(shuō)明模型的擬合程度好，試驗(yàn)誤差小。根據(jù)F 值大小可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)多糖得率的影響因素大小依次為C（護(hù)色時(shí)間）＞A（發(fā)酵時(shí)間）＞B（發(fā)酵液添加量）。

通過(guò)回歸模型分析可知，以多糖得率為指標(biāo)，護(hù)色最佳工藝為，采用發(fā)酵時(shí)間為33.93 h 的產(chǎn)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液，發(fā)酵液添加量為12%，護(hù)色時(shí)間為0.94 h。在此條件下，模型預(yù)測(cè)山藥多糖的得率為12.78%，相對(duì)褐變度為41.74%。考慮到在實(shí)際應(yīng)用中操作簡(jiǎn)便，將工藝條件修正為采用發(fā)酵時(shí)間為34 h 的產(chǎn)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液、發(fā)酵液添加量為10%、護(hù)色時(shí)間為1 h；在此條件下，多糖得率為12.44%，相對(duì)褐變度為43.05%，實(shí)際值與理論值基本相符，說(shuō)明模型對(duì)采用產(chǎn)乳酸芽孢桿菌配制護(hù)色液工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠可行，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 不同護(hù)色劑對(duì)山藥PPO和POD活性的影響

不同護(hù)色劑對(duì)山藥中PPO 和POD 的酶活性及護(hù)色效果的影響如圖4所示。

表3 多糖得率回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model of polysaccharide yield

表4 相對(duì)褐變度回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model of browning index

圖4 不同護(hù)色液對(duì)山藥中的PPO 和POD 酶活性及山藥褐變的影響Fig.4 Effect of different color protecting on PPO and POD activity and browning index

由圖4可知，最優(yōu)的發(fā)酵護(hù)色液和傳統(tǒng)亞硫酸鈉兩種護(hù)色液均能夠有效抑制PPO 和POD 活性。其中：發(fā)酵護(hù)色液對(duì)于PPO 的抑制效果顯著優(yōu)于亞硫酸鈉護(hù)色液，而兩種護(hù)色液護(hù)色后POD 活性沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。通過(guò)比較相對(duì)褐變度可知，亞硫酸鈉護(hù)色液和發(fā)酵護(hù)色液均有明顯的護(hù)色效果，其中發(fā)酵護(hù)色液的護(hù)色效果顯著優(yōu)于亞硫酸鈉護(hù)色液。

果蔬的褐變從本質(zhì)上可分為由于酚類物質(zhì)在酶的作用下氧化成能聚合形成褐色物質(zhì)的醌類的酶促褐變，以及其他非酶原因?qū)е碌姆敲负肿儍纱箢怺18-19]。山藥中的褐變以酶促褐變?yōu)橹鳎w喜亭等[20]研究表明，在山藥中，褐變發(fā)生的位置與山藥中的酚類物質(zhì)的分布情況相同，其中PPO、POD 和苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）的活性與山藥的褐變度呈正相關(guān)，其相關(guān)性依次為PPO ＞POD ＞PAL，因此PPO 是使得山藥褐變的主要因素[21-22]。根據(jù)Li 等[23]研究成果表明，產(chǎn)乳酸芽孢桿菌的產(chǎn)物中包含有乳酸，其生長(zhǎng)穩(wěn)定期為36 h～48 h，此時(shí)積累的發(fā)酵產(chǎn)物最多，而48 h 時(shí)后開始進(jìn)入衰亡期，采用產(chǎn)乳酸芽孢桿菌發(fā)酵液制備護(hù)色液，可能是因?yàn)楫a(chǎn)乳酸芽孢桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中的乳酸等發(fā)酵產(chǎn)物能夠有效的減緩山藥中的酶促褐變，以此達(dá)到護(hù)色效果。因此在本試驗(yàn)中，可能由于發(fā)酵護(hù)色液對(duì)山藥中的PPO 和POD 具有明顯的抑制效果，發(fā)酵護(hù)色液能夠起到明顯的護(hù)色效果，其中PPO 與山藥褐變的相關(guān)性大于POD，所以發(fā)酵護(hù)色液的護(hù)色效果優(yōu)于亞硫酸鈉護(hù)色液的護(hù)色效果。

2.4 不同護(hù)色劑對(duì)山藥多糖免疫活性的影響

巨噬細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子參與調(diào)控天然免疫防御和特異性免疫，其在機(jī)體防御、自身穩(wěn)定方面都發(fā)揮著重要的作用，如直接殺傷病原微生物、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，消除凋零細(xì)胞[24-25]。不同護(hù)色處理后的山藥多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的增殖率的影響如圖5所示。

由圖5可知，CYH 在質(zhì)量濃度為31.25 μg/mL～1 000.00 μg/mL 時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖率的影響與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明CYH 在該濃度下對(duì)細(xì)胞無(wú)毒，但當(dāng)質(zhì)量濃度提高至2 000 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞增殖率有明顯的提高，與空白對(duì)照組相比存在顯著差異（P＜0.05）。而CYN 在質(zhì)量濃度為31.25 μg/mL～2 000.00 μg/mL 時(shí)，隨著多糖濃度的增加，細(xì)胞的生長(zhǎng)反而受到了抑制，Zhao 等[26]研究表明，硫處理會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可能的原因是其增加了凋亡相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)，其中包括Bax and caspase-8。因此當(dāng)多糖的質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL～2 000 μg/mL 時(shí)，CYN 顯著抑制細(xì)胞的增殖。但CYF 未出現(xiàn)這個(gè)情況，相反，CYF 隨多糖的質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞增殖率增加。其中，多糖質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL 和2 000 μg/mL 時(shí)，CYF 對(duì)細(xì)胞增殖率顯著高于CYN（P＜0.05），與CYH 的細(xì)胞增殖率相近，說(shuō)明這可能是山藥多糖本身促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而采用發(fā)酵護(hù)色液處理并未對(duì)多糖的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用產(chǎn)生影響。總體而言，不同護(hù)色處理的山藥多糖對(duì)細(xì)胞增殖率的影響不同，在高濃度下（1 000 μg/mL～2 000 μg/mL）CYF 和CYH 均能顯著提高細(xì)胞增殖率，但是CYN 則極顯著抑制細(xì)胞增殖率，結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)亞硫酸鈉處理的山藥所得的山藥多糖對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用，但采用清水處理和采用發(fā)酵護(hù)色液處理的山藥所提取得到的多糖則能對(duì)RAW264.7 的增殖有促進(jìn)作用。不同護(hù)色處理的山藥多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α 的影響如圖6所示。

圖5 不同護(hù)色處理的山藥多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of Dioscorea opposita Thunb polysaccharide of different color protecting on the proliferation of RAW264.7

圖6 不同護(hù)色處理的山藥多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α 的影響Fig.6 Effect of Dioscorea opposita Thunb polysaccharide of different color protecting on TNF-α secretion of RAW264.7

由圖6可知，相對(duì)于空白對(duì)照組，加入質(zhì)量濃度為31.25 μg/mL～2 000 μg/mL 的3 種護(hù)色處理后的山藥多糖均對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α 的水平有極顯著影響（P＜0.01）。其中CYN 在31.25 μg/mL～2 000 μg/mL 的質(zhì)量濃度下，隨之山藥多糖的質(zhì)量濃度的增加，RAW264.7 細(xì)胞分泌的TNF-α 的水平呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在250 μg/mL 時(shí)達(dá)到最大值。而CYF 和CYH 在質(zhì)量濃度為31.25 μg/mL～2 000 μg/mL 時(shí)，RAW264.7 細(xì)胞分泌的TNF-α 的水平隨著山藥多糖的質(zhì)量濃度的增加而增加。通過(guò)對(duì)比可知，3 種處理后的山藥多糖均能夠提高細(xì)胞分泌TNF-α 的水平，但是CYN 在高濃度（500 μg/mL～2 000 μg/mL）下對(duì)提高RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α 的水平有所降低，但是仍然高于空白對(duì)照組，而CYF 和CYH 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α 水平存在濃度依賴性，而且兩者對(duì)于分泌水平的影響相似。通過(guò)對(duì)比可知，CYN 和CYF 對(duì)于提高RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α 的水平具有顯著差異，CYF 對(duì)于細(xì)胞分泌TNF-α 的提高顯著優(yōu)于CYN，這可能是因?yàn)榱蛱幚頊p少粗多糖的免疫調(diào)節(jié)活性可能是與其下調(diào)MAPK 信號(hào)通路有關(guān)[26]。不同護(hù)色處理的山藥多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-1β 的影響見(jiàn)圖7。

圖7 不同護(hù)色處理的山藥多糖對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-1β 的影響Fig.7 Effect of Dioscorea opposita Thunb polysaccharide of different color protecting on IL-1β secretion of RAW264.7

如圖7所示，與空白對(duì)照組相比，3 種不同護(hù)色處理后的山藥多糖對(duì)小鼠RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-1β 均有促進(jìn)作用。CYN 在1 000 μg/mL～2 000 μg/mL的質(zhì)量濃度下，能夠極顯著提高IL-1β 的分泌水平（P＜0.01），但在小于1 000 μg/mL 的質(zhì)量濃度下無(wú)顯著影響；CYF 在62.5 μg/mL～250 μg/mL 的質(zhì)量濃度下，能顯著提高細(xì)胞分泌IL-1β 的水平（P＜0.05），在500 μg/mL～2 000 μg/mL 的質(zhì)量濃度則有極顯著的影響（P＜0.01）；CYH 在250 μg/mL～2 000 μg/mL 質(zhì)量濃度下，能極顯著提高細(xì)胞分泌IL-1β 的水平（P＜0.01）。而在本試驗(yàn)濃度下，CYF 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-1β 水平的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于CYN。

3 結(jié)論

本文提供了一種優(yōu)化后的山藥的非硫護(hù)色方案，與采用亞硫酸鹽護(hù)色方案相比，本護(hù)色方案能夠有效抑制山藥的褐變，顯著降低山藥中PPO 和POD 活性，同時(shí)提高多糖得率和保護(hù)山藥多糖的活性，尤其與傳統(tǒng)含硫護(hù)色相比，采用發(fā)酵護(hù)色液處理的山藥中的山藥多糖的活性顯著優(yōu)于采用亞硫酸鈉處理的，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。