殼聚糖對牡蠣ACE抑制肽的脫腥工藝研究

張坦，梁山泉，楊敏，李萌，牟海津

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

牡蠣是世界上第一大養殖貝類，富含各種優質蛋白、鋅、硒、牛磺酸、不飽和脂肪酸等大量營養元素，具有“海洋牛奶”的美譽[1-2]。但現階段牡蠣的加工方式多以鮮食、蠔干、罐頭、蠔油等初加工為主，精深加工還未得到應有開發。血管緊張素轉換酶（angiotensinconverting enzyme，ACE）具有將血管緊張素I 轉化為有效的血管收縮劑血管緊張素II 并通過降解消除緩激肽的血管舒張作用的能力，是控制高血壓的關鍵酶[3]，以牡蠣為原料制備ACE抑制肽雖然有了一定的研究[4-6]，但大多數研究沒有考慮酶解液的腥味和風味問題，腥味使牡蠣及其他水產品的應用受到很大程度的限制，脫腥是水產品加工過程中亟待解決的重點和難點[7]。目前研究較多的脫腥方法主要有：活性炭吸附、酵母發酵、微膠囊包埋、調味劑掩蓋、美拉德反應等。活性炭吸附效果雖好，但蛋白損失率很高；酵母發酵過程不易控制，容易發酵過度，且會引入酵母味道；微膠囊包埋的脫腥效果一般，包埋率不好評價；美拉德反應條件要求較高，不易實現[8-10]。

殼聚糖作為一種天然的大分子絮凝劑，因其無毒、用量少、絮凝效果好的優點在水處理、中草藥和果汁澄清方面具有廣泛應用[11]。張彤等[12]對80 種不同藥材作了澄清試驗，并對絮凝液與水煎液、醇沉液進行了比較，結果表明殼聚糖絮凝劑對大部分單味中藥浸提液均有一定的澄清作用，能保留其中的大部分有效成分；王岸娜等[13]在用殼聚糖澄清獼猴桃果汁的研究發現，3 種不同脫乙酰度的殼聚糖組分都可以有效地澄清獼猴桃果汁。而把殼聚糖應用于水產品絮凝脫腥的研究鮮有報道。

本試驗的研究重點即應用殼聚糖對牡蠣酶解液進行絮凝離心脫腥，得到透明無腥味的牡蠣多肽液，并對多肽分子量和ACE抑制活性進行研究和分析，為開發制備低分子量、高ACE抑制活性的脫腥牡蠣肽提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）冷凍全肉：威海榮成碌對島集團；中性蛋白酶（20 萬U/g）、木瓜蛋白酶（20 萬U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；菠蘿蛋白酶（20 萬U/g）：青島佰仁生物科技有限公司；殼聚糖：國藥集團化學試劑有限公司；蛋白分子量標準品[L-色氨酸L-tryptophan（204.23 Da）、谷胱甘肽氧化型glutathione oxidized form（612.63 Da）、桿菌肽bacitracin（1 422.69 Da）、牛胰島素bovine insulin（5733.49 Da）]：北京索萊寶科技有限公司；ACE、馬尿酰組胺酰亮氨酸（hippuryl-histidyl-leucine，HHL）、馬 尿 酸（hippuric acid，HIP）標準品：美國Sigma 公司；其他試劑均為國藥分析純。

1.2 儀器與設備

HM-668T 勻漿機：廣州黑馬電器有限公司；恒溫水浴搖床：蘇州威爾實驗用品有限公司；TDL-5-A 離心機：上海安亭科學儀器廠；FD-1A 冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；SKD-100 凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司；SuperdexTM30 Increase 10/300 GL 凝膠色譜柱：美國GE 集團；Agilent 1260 高效液相色譜系統：美國Agilent 科技公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣酶解工藝優化

因牡蠣本身含鹽量很高，所以不考慮最適pH值為堿性的堿性蛋白酶、胰蛋白酶等，避免引入更多的NaCl 影響風味。

1.3.1.1 蛋白酶種類優化

冷凍全牡蠣肉自然解凍，用勻漿機勻漿（不額外添加水），調節pH 7.0，取15 g 牡蠣勻漿，控制總加酶量為1.0%（最適條件相同：50 ℃，pH7.0），各加入不同蛋白酶后，4 800 r/min 離心30 min 取清液，用凱氏定氮法測定清液和酶解液中的總氮含量，殘渣烘干至恒重后稱重，以蛋白質回收率和殘渣干重為指標考察酶解效果。

1.3.1.2 加酶量優化

牡蠣勻漿分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的中性蛋白酶（最適條件相同：50 ℃，pH7.0），酶解4 h，其他條件同1.3.1.1。

1.3.1.3 酶解時間優化

牡蠣勻漿加入0.6%的中性蛋白酶（最適條件相同：50 ℃，pH7.0），分別酶解1、2、3、4、5 h，其他條件同1.3.1.1。

1.3.2 殼聚糖脫腥

取3 g 殼聚糖溶于1%的冰乙酸溶液中，50 ℃水浴加熱3 h 至殼聚糖完全溶脹，制成3.0%的殼聚糖溶液。取50 g 酶解液，添加酶解液質量1.0%的殼聚糖溶液，輕微攪拌均勻，靜置20 min，4 800 r/min 離心不同時間，比較添加殼聚糖離心前后殘渣干重的區別，同時探究不同離心時間對殼聚糖脫腥效果及清液中固形物和蛋白質保留率的影響。脂肪含量通過氯仿甲醇法測定。

1.3.3 多肽性質分析

1.3.3.1 多肽分子量測定

樣品經反相-高效液相色譜系統（reversed-phased high performance liquid chromatography，RP-HPLC）通過凝膠過濾柱分離，色譜條件如下：色譜柱：SuperdexTM30 Increase 10/300 GL；流動相：10 mmol/L Tris-HCl 緩/+9 沖液（pH7.4，含150 mmol/L NaCl）；柱溫：25 ℃；檢測方法：紫外215 nm；流速：0.7 mL/min。標準品：（1）L-色氨酸L-tryptophan（M=204.23 Da）（2）谷胱甘肽氧化型glutathione oxidized form（M=612.63 Da）（3） 桿菌肽bacitracin（M=1 422.69 Da）（4）牛胰島素bovine insulin（M=5 733.49 Da）。

1.3.3.2 ACE抑制活性研究

測定方法采用更為精密準確的HPLC 法，具體方法在趙元暉[14]的檢測方法的基礎上稍作修改。將樣品的蛋白質濃度稀釋至一定濃度，取20 μL 樣品，加入10 μL ACE溶液（0.1U/mL），在37℃下保溫10 min 后加入10 μL HHL（5 mmol/L）溶液開始反應，37 ℃反應60 min后加入100 μL 1.0 mol/L HCl 中止反應，得到反應液。同時用20 μL 羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N′-a-hydroxythylpiperaxine-N′-etharesulfanic acid，HEPES）緩沖液替代酶解液來制備反應液，作為空白對照組。

反應液經過0.22 μm 濾膜過濾后用Zorbax SB-Aq C18 分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）進行馬尿酸峰面積的檢測，條件為柱溫25 ℃，流動相是乙腈/超純水（體積比為1 ∶1，其中水含0.1%三氟乙酸），流速0.4 mL/min，檢測波長228 nm，進樣量20 μL。IC50值定義為使馬尿酸峰面積減少50%的抑制劑濃度。

ACE抑制率/%=（1-樣品的馬尿酸峰面積/空白的馬尿酸峰面積）×100

2 結果與分析

2.1 牡蠣酶解工藝優化

2.1.1 蛋白酶種類優化

蛋白酶種類對酶解效果的影響見圖1。

圖1 蛋白酶種類對酶解效果的影響Fig.1 Effect of protease types on enzymatic hydrolysis

由圖1可以看出，中性蛋白酶單酶酶解的酶解效果最好，蛋白質回收率最高達85.0%，15 g 牡蠣勻漿得0.617 g 殘渣，兩種復合酶解方案結果與中性蛋白酶單酶酶解效果相差不大，木瓜蛋白酶效果最差，最終決定以中性蛋白酶單酶酶解。

2.1.2 加酶量優化

加酶量對酶解效果的影響見圖2。

圖2 加酶量對酶解效果的影響Fig.2 Effect of addition volume of protease on enzymatic hydrolysis

由圖2可以看出，隨著加酶量的增加，蛋白質回收率呈逐漸增大，殘渣干重呈逐漸減小的趨勢，當加酶量為0.6%時，二者趨于平穩，蛋白回收率為80.4%，殘渣干重為0.621 g，酶解基本充分，因此選擇中性蛋白酶加酶量為0.6%。

2.1.3 酶解時間優化

酶解時間對酶解效果的影響見圖3。

圖3 酶解時間對酶解效果的影響Fig.3 Effect of time on enzymatic hydrolysis

由圖3可以看出，隨著酶解時間的增加，蛋白質回收率呈逐漸增大，殘渣干重呈逐漸減小的趨勢，酶解3 h 與4 h 的蛋白質回收率無明顯差別，酶解3 h 的蛋白質回收率為82.0%，殘渣干重為0.545 g，酶解基本充分，因此選擇酶解時間為3 h。綜上所述，牡蠣酶解最佳工藝條件為：0.6%中性蛋白酶在pH7.0 50 ℃條件下酶解3 h。

2.2 殼聚糖脫腥

添加和不添加殼聚糖雜質和脂肪去除效果的比較見表1。

殼聚糖（chitosan，（1，4）-2-胺基-2-脫氧-β-D-葡聚糖）是由甲殼素（chitin，（1，4）-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡聚糖）經脫乙酰化反應得到的一種生物高分子，殼聚糖線性分子鏈上具有游離氨基，其氮原子上還有一對未結合電子，使其呈現弱堿性，能從溶液中結合一個氫原子，從而使殼聚糖成為帶陽電荷的聚電解質，與酶解液中所含的大量帶負電荷的懸浮物相互作用，使酶解液中的懸浮物纏繞于具有線性分子結構的殼聚糖分子中，使微小顆粒變為大顆粒而沉降[13]，從而展示出優異的絮凝作用。殼聚糖作為絮凝劑有無毒、用量少的優點，本身還具有免疫調節、防癌、調節腸道菌群、排除體內有毒有害物質等功能活性，美國環保局已批準殼聚糖作為飲用水的凈化劑，其在食品添加中的安全性有所保障[15]。

表1 添加和不添加殼聚糖雜質和脂肪去除效果的比較Table 1 Comparison of impurity substance and fat removal effects adding chitosan or not

牡蠣的腥味物質一般是脂溶性的醛類、酮類物質[12]，試驗研究發現，內臟團及油脂是腥味主要來源，所以重點針對這些脫除。在不添加殼聚糖情況下（如表1所示），酶解液用4 800 r/min 離心15 s 或60 s 后，清液和殘渣不能明顯地分離開，大部分是渾濁的絮狀漂浮物，小部分是上層的油狀漂浮物，沒有殘渣。4 800 r/min 離心15 min 時，溶液可分為3 層——上層油狀漂浮物（固形物5.4%）、中層清液和下層內臟團殘渣相（固形物5.4%），76.9%的脂肪分布在上層油相漂浮物中，28.9%的脂肪分布在下層殘渣中。但直接離心后，三相的分離去除操作困難，中間層的清液難以單獨分離出來。對三相進行感官評價發現，清液幾乎沒有腥味，而油相和殘渣相的腥味強烈，而該現象在以往的報道中鮮有提及。因此本研究希望通過殼聚糖絮凝，將上層油狀漂浮物轉移至殘渣相，再配合離心將酶解液分為殘渣和清液兩相，從而輕易地將清液分離出來，達到良好的脫腥脫脂和去除雜質的效果。

向酶解液中添加其質量1.0%的殼聚糖溶液（用乙酸溶液溶解制成3%的殼聚糖溶液），靜置離心。由表1可以看出，添加殼聚糖后離心15 s，即可達到很好的絮凝效果，酶解液分為清液和殘渣兩相，沒有油狀漂浮物和絮狀漂浮物，二者全部被絮凝至殘渣相，其中包括酶解液92.4%的脂肪也轉移至殘渣相，18.2%的干重雜質全部轉移至殘渣中，81.8%的固形物全都轉移至清液，并且可以輕易去除殘渣、保留清液。而在殘渣干重中，48.8%的成分是油脂，還有部分蛋白質、糖類等。增加離心時間至60 s、15 min，絮凝效果相差不大，脫腥效果和脂肪去除率基本沒有差別。因此4 800 r/min離心15 s，即可達到預想效果，想較于不添加殼聚糖直接離心，大大縮短了離心時間，并且達到了很好的脫腥脫脂和去除雜質的效果。添加殼聚糖前后清液的成分分析見表2。

表2 添加殼聚糖前后清液的成分分析Table 2 Component analysis before and after adding chitosan in clear liquid

由表2可以看出，不加殼聚糖離心15 min 和添加殼聚糖離心15 s 相比較，后者的固形物回收率和蛋白質回收率稍有降低，但可以忽略不計；前者的殘渣干重占5.4%，后者達到18.2%，當殘渣聚合在一起時可以更輕易去除；前者的脂肪清除率雖然可以達到86.4%，但是清液不易分離，后者可達92.4%且易離心分離。

殼聚糖作為一種天然的絮凝劑，目前在水處理、中草藥和果汁澄清方面具有廣泛應用，但用于水產制品的絮凝、脫腥還鮮有報道。本試驗的研究重點是通過添加殼聚糖絮凝離心，在保證蛋白質和固形物損失率很低的前提下，解決了酶解液直接離心清液不易分離的問題，同時也將雜質和漂浮物中的油脂去除，這不僅去除了脂溶性的腥味物質，同時降低了脂質氧化的風險，提高了產品的穩定性。分離后的清液經噴干或凍干得到的牡蠣多肽粉，可迅速溶于水，水溶液清澈透明，為淡黃色液體，無腥味，無沉淀析出，入口清爽鮮香。

2.3 多肽性質分析

2.3.1 多肽分子量測定

多肽分子量的SuperdexTM30 Increase 10/300 GL色譜圖見圖4。

由圖4可以看出，牡蠣多肽各組分基本可以完全分離開，標準曲線線性關系良好，牡蠣多肽的分子量都在5 000 Da 以下，其中1 000 Da 以下的組分占93.1%，500 Da 以下的組分約占49.7 %，多為二肽或三肽。Oshima 等[16]最早報道食品蛋白源ACE抑制肽是由細菌膠原酶降解明膠獲得的6 條活性肽，并證實抑制ACE 活性的肽分子質量主要集中在1 500 Da 以下。王桂春等[17]通過分布酶解酪蛋白制備小分子ACE抑制肽，兩次酶解的產物分子量集中在1 000 Da 以下，這與本研究的結果相似。有研究發現二肽或者三肽由于能夠抵抗胃腸道肽酶的作用，直接被吸收，從而能有效的發揮降血壓作用。牡蠣蛋白經過中性蛋白酶酶解之后，分子質量大大減小，這為之后研究小分子肽的ACE抑制作用提供了一定的基礎。

2.3.2 ACE抑制活性分析

Zorbax SB-Aq C18 分析樣品的ACE抑制活性見圖5。

圖4 多肽分子量的SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL 色譜圖Fig.4 The chromatography of oyster peptide by SuperdexTM 30 Increase 10/300 GL

圖5 Zorbax SB-Aq C18 分析樣品的ACE抑制活性Fig.5 The chromatogram of ACE inhibitory activity of sample by Zorbax SB-Aq C18

對于ACE抑制活性的測定方法，相較于用乙酸乙酯萃取馬尿酸后測定吸光值的方法來說，HPLC 結果更為準確、誤差更小，而選擇合適的柱子和方法將HHL 與HIP 完全分離開是關鍵。本試驗方法在趙元暉[14]研究的基礎上，減少HHL 的用量，從而減少圖譜中HHL 的峰高，更好地凸顯產物HIP 的峰形，減少HIP的峰面積誤差，并且整個體系用量減少一倍，從而降低了檢測成本。由圖5可以看出，經改進后的方法可以將HHL 和HIP 完全分離開，空白組中HHL 的洗脫時間為5.454 min，HIP 洗脫時間為6.160 min，樣品中HHL的洗脫時間為5.469 min，HIP 洗脫時間為6.166 min，樣品濃度為2 mg/mL 時，ACE抑制率達79.13%。不同濃度牡蠣肽的ACE抑制活性見圖6。

圖6 不同濃度牡蠣肽的ACE抑制活性Fig.6 The ACE inhibitory activity of different concentration oyster peptide

圖6表示了不同濃度樣品的ACE抑制活性，經計算樣品的IC50為0.475 mg/mL。于婭等[18]采用酶解方法制備的牡蠣功能短肽，0.4 mg/mL 對ACE抑制率為51.4%。邱娟等[19]采用復合蛋白酶和堿性蛋白酶對牡蠣進行分步酶解，得到牡蠣多肽的ACE抑制活性IC50為0.8 mg/mL。歐成坤等[20]經酸性蛋白酶得到的水解度為16%的酶解產物，蛋白質濃度為1 mg/mL 時，對ACE的抑制率為71.7%。Bordenave 等[21]檢測了太平洋牡蠣酶解產物的ACE抑制活性，水解物對ACE的IC50為72mg/L。趙元暉[14]酶解海地瓜經超濾分離后得到的ACE抑制肽，其IC50為0.62 mg/mL。與現有文獻報道，本研究得到的牡蠣ACE抑制肽的活性處于中等偏上水平。但因檢測方法和蛋白濃度測定方法的不同，各個結果都有一定誤差，改進后的方法重現性和適用性良好，分析時間短，靈敏度和準確性高。

3 結論

本研究優選中性蛋白酶對牡蠣進行酶解，優化了酶解條件：用0.6%中性蛋白酶在pH7.0、50 ℃條件下酶解3 h，加酶量少，酶解時間短，工藝簡單。創新點在于應用殼聚糖對優化后的牡蠣酶解液進行絮凝離心脫腥，填補了殼聚糖對水產制品絮凝脫腥的空白，4800r/min離心15 s 即可達到顯著的脫腥效果，固形物保留率80.5%，蛋白質保留率79.5%，脂肪清除率達92.4%，在保證蛋白質和固形物損失率很低的前提下，解決了酶解液直接離心清液不易分離的問題，同時也將漂浮物中的油脂去除，這不僅去除了脂溶性的腥味物質，同時降低了脂質氧化的風險，提高了產品的穩定性。在得到透明無腥味的牡蠣多肽后，對多肽分子量進行分析，1 000Da 以下的占93.1%，500 Da 以下的約占49.7%，對牡蠣多肽的ACE抑制活性進行研究，IC50為0.475mg/mL，活性處于中等水平。研究為制備低分子量、較高ACE抑制活性的脫腥牡蠣肽提供了理論支持。不足之處在于還需要對不同脫乙酰度和不同分子量的殼聚糖絮凝脫腥情況作進一步的深入研究。