乳酸菌發酵柑橘皮的工藝研究及優化

崔欣悅，凌空，周明，王雨晴，谷瑞增，陸路

（中國食品發酵工業研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京100015）

我國是柑橘主要原產國之一，有著長達4 000 余年的種植史，種植面積及總產量位居世界第一（2016年產量達3600 萬噸）[1]。柑橘類產品因易剝皮和口感良好等優勢受到消費者青睞。近年來，隨著柑橘加工產業的發展，非冷凍濃縮汁（non-frozenconcentrate，NFC），罐頭，蜜餞和果酒等加工產品地位不斷上升。柑橘皮做為主要加工副產物，約占主要果重的25%～40%，主要由黃酮類物質，纖維素，果膠，維生素C，類胡蘿卜素和果膠等成分組成[2]，具有良好的利用價值。而在我國，對于柑橘皮的處理主要采用填埋處理方法，不再進行進一步的深加工處理，造成環境的嚴重污染和資源浪費[3]。

陳皮，又名橘皮、貴老、紅皮、黃橘皮、廣橘皮、新會皮、柑皮、或廣陳皮，是蕓香科柑橘屬植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮。市場中常見的陳皮主要分為川陳皮，廣陳皮，江西陳皮等，主要產于我國四川、江西、廣東和湖南等地。陳皮因具有健脾理氣，燥濕化痰等功效常被用于傳統中藥當中。陳皮中主要活性成分為黃酮類物質及其揮發油。黃酮具有多種生物活性，特別是在抗腫瘤、降血脂和抗氧化等方面[4-6]。中醫理論認為“陳久者良”即其貯存時間越久其藥理活性越強，其中的黃酮類物質含量會隨著儲存時間的增加而增加[7]，這也使得年份較久的陳皮價格相對于年份較短的價格要高出很多。

本試驗以柑橘皮做為原料，5 種實驗室自行分離鑒定的乳酸菌做為出發菌，利用微生物發酵技術將其中黃酮類物質進行提取并盡可能提高其含量，再與市售陳皮中的黃酮含量進行對比，隨后通過單因素、響應面等試驗方法，對其發酵過程條件進行優化，以尋得最佳發酵工藝手段。為開發利用柑橘皮中的主要活性物質資源，發展高效微生物發酵手段奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

柑橘皮：市售；菌種：5A-1-1（類干酪乳桿菌）；1C-2（短乳桿菌）；ff001（植物乳桿菌植物亞種）；ff002（嗜酸乳桿菌）；ff003（腸膜明串珠菌腸膜亞種）：均來自實驗室內自行鑒定保藏；MRS 培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；川陳皮素、桔紅素、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、木犀草素、柚皮素、芹菜素和異鼠李素，純度均≥99%：上海源葉生物技術有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）：德國Merck；甲酸（色譜純）：迪馬科技；乙酸銨（質譜純）：Sigma-Aldrich；試驗用超純水（18.2 MΩ·cm）由Milli-Q 純水系統制備。

pH 計（S20P 型）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；粉碎機（JS39D-250 型）：蘇泊爾電器；生物安全柜（1389A2 型）：美國Thermo；恒溫震蕩培養箱（HZQ-211C 型）：上海一恒科學儀器有限公司；水浴鍋：蘇州珀瓦爾實驗設備有限公司；超高效液相色譜儀Nexera X2、三重四極桿質譜儀聯用系統（具體包括：LC-30AD×2 輸液泵，SIL-30AC 自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A 系統控制器，LCMS-8060 三重四極桿質譜儀，LabSolutions Ver. 5.91 色譜工作站）：島津（上海）實驗器材有限公司；分析天平（XS205DU 型）：美國Mettler Toledo；渦旋混合儀（QL-901 型）：中國其林貝爾儀器制造有限公司

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵柑橘皮工藝流程

發酵柑橘皮的工藝流程如圖1所示。

圖1 柑橘皮發酵工藝流程Fig.1 The fermentation process of citrus peel

1.2.2 柑橘皮發酵液中黃酮含量的測定

分別準確稱取9 種黃酮標準品粉末20.0 mg，加甲醇溶解，渦旋混勻，定容至100 mL，即得200 μg/mL 的標準儲備液。分別取500 μL 上述標準儲備液，定容至10 mL，得到混合標準中間工作液10 μg/mL。將上述混合標準中間工作液用純甲醇逐級稀釋至0.98、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250 ng/mL 的系列標準工作溶液。

液相色譜條件：色譜柱：Shim-pack GIST（2.1 mm I.D.×100 mm L.，3 μm）；流動相：A 為0.1%甲酸、1 mmol/L乙酸銨水溶液，B 為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：B 相初始濃度為20%；0～6.0 min，20%～50%B；6.0 min～8.0 min，50%～80%B；8.0 min～8.1 min，80%～100%B；8.1 min～10 min，100%B；10 min～10.1 min，100%～20%B；10.1 min～14 min，20%B；流速：0.2 mL/min；進樣體積：1 μL；柱溫：40 ℃。質譜條件：離子化模式：ESI；加熱模塊溫度：400 ℃；霧化氣流速：3.0 L/min 干燥氣流速：10.0 L/min；接口電壓：4 kV；加熱氣流速：10.0 L/min；DL 溫度：250 ℃；接口溫度：300 ℃。

1.2.3 單因素試驗

選擇發酵前后黃酮含量變化最高的一株單菌種進行單因素試驗考察，分別對碳源添加量、接種量、發酵時間及皮水比進行考核，探究相關因素對發酵過程中橘皮總黃酮（mg/g）含量的影響，確定各單因素合適的發酵條件，為柑橘皮中總黃酮含量的提高提供參考范圍，每個因素設置3 個平行。

1.2.4 響應面分析試驗

通過單因素試驗結果確定響應面試驗設計的因素和水平，選取碳源添加量（A），接種量（B），發酵時間（C）為試驗因素。采用中心組合試驗Box-Behnken 設計試驗因素與水平，如表1所示，試驗結果用Design Expert 8.1 分析，確定各因素及因素之間的交互作用對橘皮中總黃酮含量的影響，優化發酵工藝條件[8-9]。

表1 Box-Behnken 試驗設計Table 1 Design of Box-Behnken experiment

2 試驗結果

2.1 菌種的篩選

利用三重四極桿質譜儀聯用系統條件對5 株不同乳酸菌發酵的柑橘皮發酵液進行黃酮含量測定，其測定結果見圖2。

如圖2所示，利用三重四級桿液質聯用儀對5 株單菌在發酵過程中9 種不同黃酮類物質的含量變化進行測定。發酵液中檢測到的川陳皮素、桔紅素及蘆丁含量較高，其中不同菌株在發酵過程中的川陳皮素含量均有所升高，菌株5A-1-1 變化尤為明顯。相對于川陳皮素而言，發酵液中的槲皮素、金絲桃苷、木犀草素、芹菜素、異鼠李素及柚皮素等含量較低，在發酵過程中各菌株變化趨勢不同，且通過圖2b 及圖2g可以發現，隨著發酵時間的增加ff002 中的槲皮素及ff001 中的芹菜素在發酵后期的含量降至0 μg/kg，這說明乳酸菌在發酵過程中充分分解利用了這部分的黃酮以滿足自身的生長所需。黃酮類物質含量隨著發酵過程中交替增減，可以推測在乳酸菌的作用下，柑橘皮中的黃酮產生了復雜形勢的生物轉化。

圖2 發酵過程中不同種類黃酮含量測定Fig.2 The concentration of different kinds of flavonoid during fermentation process

采用液相色譜對不同菌株發酵過程中總黃酮含量的變化進行測定，測定結果如圖3所示。

圖3 發酵液中總黃酮含量測定Fig.3 The content changes of total flavonoids

同時，對總黃酮的變化量進行計算（圖3），同起始發酵液中的總黃酮濃度相比，含5 株單菌的發酵液中的總黃酮含量均有增加，其中5A-1-1 變化含量與其他單菌相比最為明顯，由0.132 mg/g 變化至0.174 mg/g。綜合分析發現，菌株5A-1-1 在發酵過程中的黃酮含量顯著升高，繼而選為最優菌用于單因素試驗及響應面分析。

2.2 單因素影響試驗

2.2.1 碳源添加量的影響

在接種量為3%、發酵時間為5 d、皮水比為1 ∶4（質量比）的條件下，不同比例的碳源添加量對發酵液中總黃酮含量影響見圖4。

圖4 碳源添加量對發酵液中總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of carbon sources addition on the content of total flavonoids in orange peel

當碳源添加量為總體積分數的3%時，發酵液中的總黃酮含量最高，隨后隨著碳源添加的增加而減少，說明在一定添加量的基礎上，碳源的增加不會提高橘皮發酵液中總黃酮的含量，可能會使黃酮在發酵液中分解，考慮到這一點，遂選取2%、3%、4%的碳源添加量進行響應面分析。

2.2.2 接種量的影響

在碳源添加量為3%、發酵時間為5 d、皮水比為1 ∶4（質量比）的條件下，考察不同接種量比例對發酵液中黃酮含量的影響如圖5所示。

圖5 接種量對發酵液中總黃酮含量的影響Fig.5 Effect of inoculum concentration on the content of total flavonoids in orange peel

研究結果表明，隨著接種量的升高，發酵液中的黃酮含量在接種量為3%時達到最高為0.198 mg/kg，隨后逐漸下降，故選擇接種量為2%、3%、4%做響應面分析。

2.2.3 發酵時間的影響

在碳源添加量為3%、接種量為3%、皮水比為1 ∶4（質量比）的條件下，不同發酵時間對發酵液中黃酮含量的影響如圖6所示。

圖6 發酵時間對橘皮中總黃酮的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the content of total flavonoids in orange peel

由圖6可知，當發酵時間為2 d 時，發酵液中的黃酮含量最高為0.19 mg/kg，隨著發酵時間的增加，發酵液液中的黃酮含量逐步減少，這可能由于培養基中相關營養成分被消耗，菌種還是利用黃酮以滿足自身代謝需求，選擇1、2、3 d 為發酵時間進行響應面分析。

2.2.4 皮水比的影響

在碳源添加量為3%、接種量為3%、發酵時間為5 d 條件下，不同比例的橘皮與水的皮水比對發酵液中黃酮含量的影響如圖7所示。

圖7 皮水質量比對橘皮中總黃酮的影響Fig.7 Effect of solid-liquid mass ratio on the content of total flavonoids in orange peel

由圖7可知，皮水比為1 ∶4（質量比）時得到的發酵液總黃酮含量最高。測定結果表明，過低皮水比1 ∶1（質量比）或過高皮水比1 ∶8（質量比）均會影響發酵液狀態。當皮水比過低時由于底物濃度過大，會對酶的催化起到抑制作用，同樣，當皮水比過高時，酶濃度過低，酶解反應不夠充分，導致發酵液中總黃酮的含量降低。綜合考慮，為得到總黃酮含量較高的發酵液，在進行響應面試驗時，將選擇1 ∶4（質量比）的皮水比進行試驗，不再考慮其他皮水比。

2.3 響應面試驗結果與方差分析

根據Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，綜合上述單因素試驗結果，進行三因素三水平響應面試驗，結果如表2所示，對數據的方差分析結果見表3。

表2 響應面法試驗設計及結果Table 2 Design and result of response surface experiment

表3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

利用Design-Expert 8.0 軟件，對上述試驗結果進行二次回歸擬合，建立的回歸方程如下所示：

Y=-0.312 22+0.141 87A+0.165 62B+0.109 50C+0.018755AB+3.45000×10-3AC-0.020758BC-0.031467A2-0.024 425B2-0.014 765C2。（式中Y：總黃酮含量預測值；A、B、C分別代表碳源添加量、接種量、發酵時間的編碼值。）

從表3 方差分析結果可得出，整體模型的F=78.94，P＜0.000 1，表明試驗所采用二次回歸方程模型高度顯著，在統計學上有意義。試驗的失擬項P=0.218 4＞0.05，無失擬因素存在，對模型有利。同時該模型方程決定系數R2=0.990 2，表明回歸方程擬合程度良好，自變量與響應面之間線性關系顯著，能夠用于橘皮中總黃酮含量檢測試驗的理論預測[10]。對比影響總黃酮含量的因素為：碳源添加量（A）＞接種量（B）＞發酵時間（C）。

采用Box-Behnken 試驗模型對碳源添加量、接種量、發酵時間3 個因素交互作用進行分析，分析結果如圖8所示。

由圖8可以看出，對碳源添加量、接種量、發酵時間3 個因素交互作用分析，得到了交互因子的響應曲面圖。其分析表明等高線圖均為橢圓形，響應面三維圖均有穩定點，且為極大值。結果顯示接種量和碳源添加量、接種量和發酵時間均具有交互性（P＜0.05），碳源添加量和發酵時間的交互作用不具有顯著性（P＞0.05）。通過數據的處理分析，得到響應面R 的最大預測值為0.214 247mg/g，此時碳源添加量為3.25%、接種量2.97%、發酵時間2 d。為檢驗模型的準確性，采用優化后的最佳發酵條件進行試驗，3 次試驗檢測出的總黃酮含量平均值為（0.208 667±0.008）mg/g。實際值與預測值接近，說明該回歸模型優化的發酵工藝是有效的。

圖8 Box-Behnken 試驗模型響應面三維圖和等高線圖Fig.8 Response surface three-dimensional diagrams and contour maps of Box-Behnken experiment

3 討論與結論

本研究以新鮮柑橘皮為主要發酵原料，利用試驗室5 種不同乳酸菌對其進行發酵試驗，通過LC-MS 對培養過程中發酵液中的黃酮類物質進行檢測，結果表明柑橘皮中富含多種黃酮類物質成分，其中以川陳皮素、桔紅素及蘆丁為主。川陳皮素及桔紅素是多甲氧基黃酮中的兩類常見物質，其廣泛存在于柑橘屬植物中，由于其具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗誘變等生理活性[11-13]，近年來得到了國內外學者的較多專注，Whitman SC 等[14]研究發現川陳皮素可有效減少血漿膽固醇在體內的富集，從而抑制巨噬細胞的形成來阻止抗動脈粥樣硬化。李蘭英等[15]研究表明陳皮中多甲氧基黃酮類成分可以抑制人肝癌細胞株SMMC-7721 及HepG2 細胞的生長，并對其增殖呈現時間和濃度的依賴性。

采用5 種實驗室常見乳酸菌菌種進行前期初步篩選，通過發酵液中黃酮含量的對比篩選出發酵性能優良的一株乳酸菌（5A-1-1），在一定皮水比前處理的基礎上，探究柑橘皮發酵最佳工藝條件，確定碳源添加量、接種量及發酵時間的最佳組合，其最佳發酵工藝條件為：碳源添加量為3.25%、接種量2.97%、發酵時間2 d，皮水比1 ∶4（質量比），在該發酵條件下可有效提高發酵液中總黃酮含量，其得率由0.17 mg/g 提高至0.208 mg/g。

本試驗通過發酵手段及對發酵條件的有效控制實現對柑橘皮的深加工處理，提高了生物轉換效率，最大程度實現其本身功能物質的轉化和利用，避免了環境污染與資源浪費，同時為今后利用柑橘皮發酵工藝實現產業化生產奠定了基礎。